Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Magnetresonanztomographie
- Wenden Sie die MRT an, wenn die Tumorgröße einen Durchmesser von etwa 5 - 7 mm hat, in der Regel 2~4 Wochen nach der Zellimplantation. Verwenden Sie einen MRT-Scanner für die Bildgebung von Kleintieren oder einen klinischen MR-Scanner, der mit einer speziellen Spule für die Bildgebung von Kleintieren ausgestattet ist.
Anmerkung: Wir verwendeten einen 9,4 T MR-Scanner für Kleintiere mit einer Kombination aus einem 1H Volumenresonator/Sender und einem Oberflächenspulenempfänger (30 mm Durchmesser) (Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA). Eine Oberflächenspule sorgt für ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis (SNR).
- Bereiten Sie ein MRT-Kontrastmittel auf Gadoliniumbasis vor, das jedem Tier ~0,1 - 0,2 mmol/kg in ~0,1 - 0,2 ml PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) injiziert.
Anmerkung: Wir verwendeten Gadoteridol und injizierten 0,2 mmol/kg in 0,15 ml PBS über einen Zeitraum von 15 Sekunden (0,1 ml/s).
- Bereiten Sie ein Mikro-Polyethylen-Rohr vor (Länge: 7,62 mm, Innendurchmesser: 0,28 mm, Außendurchmesser: 0,64 mm). Führen Sie eine 30 g Nadel (12,7 mm Länge) in ein Ende der Tube und eine 30 g stumpfe Nadel (9,5 mm Länge) in das andere Ende ein. Verbinden Sie eine 1-ml-Spritze mit dem MR-Kontrastmittel mit der stumpfen Spitze und drücken Sie die Spritze langsam an, um das gesamte Röhrchen mit dem MR-Kontrastmittel zu füllen.
- Betäuben Sie die Tiere durch Beatmung mit ~1 - 2 % Isofluran, gemischt mit Sauerstoff (2 l/min) während der Vorbereitung und Bildgebung. Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch den Zehenkneifreflex. Tragen Sie veterinärmedizinische Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern. Erweitern Sie die Schwanzvene mit einer Wärmelampe, bevor Sie die Nadel einführen. Nehmen Sie die Mitte der 30-G-Nadel mit einer Kelly-Pinzette und führen Sie sie in die Schwanzvene ein. Kleben Sie sowohl den Schwanz als auch den Schlauch auf ein Stück Plastik- oder Kartonpapier (10 mm Breite x 100 mm Länge), um den Schwanz gerade zu halten.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage in ein Tierbett, das mit zirkulierendem warmem Wasser (oder warmer Luft) ausgestattet ist, um die Körpertemperatur während der Bildgebung zu regulieren. Stellen Sie die Temperatur auf dem Bett auf 37 °C ein. Führen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein, um die Körpertemperatur während der Bildgebung zu überwachen.
- Tragen Sie ein orthogonal gebogenes Kunststoffbrett in den Bauchbereich auf. Stellen Sie sicher, dass sich der Tumor hinter dem oberen Ende des Bretts befindet, und ziehen Sie das Brett dann leicht (~2 mm) nach unten, um sicherzustellen, dass der Tumor vom Brett aufgefangen wird. Kleben Sie das Brett fest auf das Tierbett.
- Kleben Sie einen Schallkopf für das Beatmungspad (SA Instrument, Inc., Stony Brook, NY) auf den Brustbereich, um die Atmung der Tiere während der Bildgebung zu überwachen. Lege eine Oberflächenspirale auf die Oberseite der Tumorregion und klebe sie fest auf das Tierbett. Schieben Sie das Tierbett in den MRT-Scanner, um die Tumorregion in der Mitte der Volumenspule (Innendurchmesser: 72 mm) zu platzieren.
- Führen Sie sowohl für den Empfänger als auch für den Sender eine Anpassung und Abstimmung durch, gefolgt von einer Shimming.
- Beginnen Sie mit einer anatomischen MRT-Sequenz, um den Tumor zu lokalisieren. Verwenden Sie eine T2-gewichtete (T2W) Turbo-Spin-Echo-Sequenz, um axiale Bilder mit den folgenden Aufnahmeparametern zu erhalten. Repetitionszeit (TR)/Echozeit (TE) = 3.000/34 ms, 128 x 128 Matrix, 30 x 30 mm Sichtfeld, Anzahl der Mittelwerte = 1, Echozuglänge = 4 und 20 zusammenhängende 1 mm dicke Schichten im Interlaced-Modus, um die gesamte Tumorregion abzudecken (Gesamtscanzeit: 1,6 min).
Anmerkung: Da orthotope Pankreastumoren schwieriger zu lokalisieren sind als subkutane, sind herkömmliche Lokalisationsbilder mit geringerer Auflösung möglicherweise nicht sinnvoll.
- Erfassen Sie T1-gewichtete (T1W) Bilder mit verschiedenen Spiegelwinkeln, um die T1-Karte abzurufen. Verwenden Sie zu diesem Zweck einen Gradientenecho-Multiflip-Winkel-Ansatz mit folgenden Parametern: Repetitionszeit (TR)/Echozeit (TE) = 115/3 ms, 128 x 128 Matrix, ein 30 x 30 mm Sichtfeld, Anzahl der Mittelwerte = 4, ~5 - 7 zusammenhängende 1 mm dicke Schichten in einem Interlaced-Modus, um die Tumorregion abzudecken, und sieben Flip-Winkel von 10, 20, 30, 40, 50, 60 und 70 (Gesamtscanzeit pro Schwenkwinkel: 1 min).
Anmerkung: Der Multiflip-Winkel-Ansatz ist jedoch nur dann effizient, wenn die Homogenität des B1-Feldes hoch ist. Wenn nicht, können T1-Maps stattdessen mit einem multiplen TR-Ansatz erhalten werden.
- Erfassen Sie T1W-Bilder vor und nach der Gadolinium-basierten MRT-Kontrastinjektion. Verwenden Sie die gleichen Erfassungsparameter und die gleiche Geometrie für das T1-Mapping, jedoch mit dem festen Flip-Winkel von 30. Verwenden Sie eine lineare Codierung, um einen stationären Zustand zu gewährleisten, wenn der Mittelpunkt des k-Raums erreicht wird, insbesondere wenn ein kurzer TR und ein Flip-Winkel mit niedrigem Grad verwendet werden. Nehmen Sie 5 Basisbilder vor der Kontrastinjektion auf. Nehmen Sie dann 40 Bilder nach Kontrastmittelinjektion auf (Gesamtscanzeit: 45 min). Verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um Kontrastmittel mit einer konstanten Rate (0,01 ml/s) zu injizieren.
- Überwachen Sie die Atmung der Tiere kontinuierlich und passen Sie die Isoflurankonzentration an, um die Atemfrequenz auf 50 bis 100 Atemzüge pro Minute zu halten. Überwachen Sie die Körpertemperatur der Tiere während der gesamten Bildgebung.
- Nehmen Sie nach Abschluss der DCE-MRT die Nadel und andere Sonden ab und setzen Sie das Tier in einen leeren Käfig, der mit Papiertüchern bedeckt ist. Massieren Sie sanft den unteren Bauchbereich. Der Käfig sollte zur Hälfte unter eine Wärmelampe gestellt werden, damit sich das Tier während seiner Genesung in den Wärmegradienten hinein- und herausbewegen kann. Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
