1. Vorbereiten von 3D-Tumorsphäroiden, die in ECM eingebettet
sind
- Bereiten Sie einen Arbeitsplatz mit den benötigten Materialien in einer Laminar-Flow-Haube vor.
- Bereiten Sie eine verdünnte Mischung aus Carboxylat-modifizierten Fluoreszenz-Tracersonden mit einem Durchmesser von 1 μm vor, indem Sie 2 Teile Stammsonden (2 % Feststoffe) zu 25 Teilen sterilem Wasser hinzufügen.
- Nehmen Sie eine Flasche mit 3,1 mg/ml Rinderkollagen aus dem Kühlschrank und legen Sie sie auf Eis.
- Aliquotieren Sie 125 μl Kollagen in eine leere 2-ml-Durchstechflasche.
- Geben Sie 50 μl verdünnte Tracersondenlösung in das Fläschchen mit dem Kollagen und wirbeln Sie es kurz ein, um die Sonden zu verteilen.
- Geben Sie 235 μl eines geeigneten Zellkulturmediums mit Phenolrot (das gelb wird) für ein Gesamtvolumen von 410 ml hinzu und wirbeln Sie es kurz ein, bevor Sie 205 ml (die Hälfte des Gesamtvolumens) entfernen und in ein neues 2-ml-Fläschchen geben. Fläschchen 1 enthält das Tumorsphäroid und Fläschchen 2 ist eine Kontrollmischung.
- Geben Sie ~2 μl 1 M NaOH in Fläschchen 1, um die Lösung wieder auf den neutralen pH-Wert zu bringen (Nährmedien, die Phenolrot enthalten, sollten wieder rot werden). Beachten Sie, dass dies dazu führt, dass die Mischung zu härten beginnt, wenn sie nicht auf Eis aufbewahrt wird. Zum Mischen kurz vortexen, dann sofort zurück zum Eiseis.
Anmerkung: Das Sphäroid ist nach 9 Tagen Kultur mit bloßem Auge kaum noch zu erkennen, und seine Entnahme aus dem Agarosebett ist eine heikle Aufgabe. Die Verwendung eines Präpariermikroskops kann für einige Benutzer hilfreich sein. Die Aufrechterhaltung der Integrität des Sphäroids während des Transfers ist von größter Bedeutung.
- Entfernen Sie mit einer Weithalspipettenspitze vorsichtig 40 μl des Mediums aus der Vertiefung, die das Tumorsphäroid enthält. Behalten Sie diese 40 μl bei, während Sie den nächsten Schritt durchführen.
- Überprüfen Sie die Vertiefung, um festzustellen, ob das Sphäroid im vorherigen Schritt entfernt wurde. Wenn dies der Fall ist, geben Sie die 40 μl mit dem Sphäroid in Fläschchen 1. Wenn nicht, geben Sie die 40 μl zurück in die Vertiefung und wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
- Rühren Sie Fläschchen 1 vorsichtig um (riskieren Sie keine Verwirbelung, da dies das Sphäroid beschädigen kann), bevor Sie die Mischung in 60-μl-Portionen in drei separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte umfüllen. Untersuchen Sie jede Vertiefung mit einem Mikroskop, nachdem Sie die Mischung hinzugefügt haben, um festzustellen, welche Vertiefung das Sphäroid enthält.
- ~2 μl, 1 M NaOH und 40 μl Zellkulturmedium in Fläschchen 2 geben und vortexen, bevor 60 μl dieser Mischung in eine leere Vertiefung in der 96-Well-Platte aliquotiert und als Kontrolle markiert werden.
- Legen Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator, um sie mindestens 1 Stunde lang auszuhärten.
2. Erstellen Sie ein Raster von Beispielpunkten und machen Sie an jedem Punkt ein Video
- Übertragen Sie die Probenplatte aus dem Inkubator auf den Mikroskoptisch. Lassen Sie die Probe 10 Minuten lang mit der Raumtemperatur ausgleichen, wenn kein beheizter Tisch zur Verfügung steht.
- Beobachten Sie die Probe mit Objektiven mit geringer Leistung, um sicherzustellen, dass sie intakt und bereit für die Bildgebung ist. Bestimmen Sie die Position des Tumors innerhalb der Vertiefung.
- Entscheiden Sie, wie viele Stichprobenpunkte entnommen werden sollen. In der Regel liefern 20 Probenpunkte in jeder Vertiefung, die in konzentrischen Ringen um das Sphäroid verteilt sind, ausreichend detaillierte Ergebnisse.
- Bewegen Sie den Tisch in jede gewünschte Position und verwenden Sie die Mikroskop-Schnittstellensoftware, um die x- und y-Koordinaten aufzuzeichnen (oder zeichnen Sie die Koordinaten manuell auf, wenn die Schnittstellensoftware nicht verfügbar ist).
- Schalten Sie das Mikroskop auf ein leistungsstarkes Objektiv (typischerweise 100X) um und wählen Sie den geeigneten Filterwürfel für die Anregungswellenlänge der Tracersonden aus. Verwenden Sie die Liste der Punkte, die Sie in Schritt 2.4 erstellt haben, um zum ersten Punkt im Raster zu gelangen.
- Passen Sie den Fokus an, um den Boden des Wells zu finden, und bewegen Sie sich dann nach oben, um ein Sichtfeld (FOV) zu finden, das mehrere fokussierte Tracersonden enthält.
- Beobachten Sie das Intensitätshistogramm und passen Sie die Belichtungsintensität und -zeit an, um den größtmöglichen Dynamikbereich zu erzielen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das Bild nicht übersättigt wird.
- Erhalten Sie eine Videosequenz mit einer Bildrate von 20-30 ms pro Frame (ca. 800 Bilder oder 16-24 Sekunden Länge werden empfohlen, um ausreichende Statistiken für eine robuste MSD-Berechnung bereitzustellen, die mit der Notwendigkeit einer Minimierung der Erfassungszeit an jedem räumlichen Gitterpunkt in Einklang gebracht werden) und speichern Sie mit einer geeigneten Konvention. Berühren Sie während der Aufnahme nicht das Mikroskop oder den Tisch.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6 bis 2.9 für jeden Abtastpunkt im Raster.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.10 für jede Vertiefung im Experiment.
