Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Transduzieren von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien
- Transduzieren Sie Pankreaskarzinomzellen, um Luciferase zu exprimieren, wie zuvor beschrieben. Panc-1 und Capan-1 Pankreaskarzinom-Zelllinien, die mit Glühwürmchen-Luziferase transduziert wurden, werden hier verwendet.
Hinweis: Es kann auch Renilla-Luziferase oder bakterielle Luziferase verwendet werden.
2. Vorbereitung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen
- In Kultur wurden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen transduziert, bis sie zu 70 % konfluiert waren.
- Heben Sie die Pankreaszellen an und stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit mehr als 90 % beträgt.
- Resuspendieren Sie bei 2 x 107 Zellen/ml in einer 3:2-Mischung aus gekühltem Matrigel:Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Bewahren Sie die Matrigel-Zellsuspension vor der Injektion in die Bauchspeicheldrüse auf Eis auf.
HINWEIS: Um eine schnelle Verfestigung von Matrigel zu gewährleisten, reduzieren Sie das PBS-Volumen, um das Volumen des Zellpellets zu berücksichtigen. Behandeln Sie Matrigel immer mit eiskalten Instrumenten und Spritzen, um eine Verfestigung vor der Injektion zu vermeiden. Die vorgeschlagene Zellzahl ist ein Anhaltspunkt und sollte für jede Zelllinie empirisch bestimmt werden.
3. Vorbereitung der Maus
- Betäuben Sie die Maus mit inhalativem 2-3% Isofluran. Bestimmen Sie die Narkosetiefe durch fehlenden Pedalreflex bis hin zu einem sanften Einklemmen der Zehen.
- Tragen Sie Gleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Positionieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einem 37 °C heißen Heizkissen und drehen Sie die Maus vorsichtig, um die linke Seite des Bauches anzuheben.
- Bereiten Sie den Bauch mit einer 10%igen Povidon-Jodlösung vor.
HINWEIS: Anstelle einer Inhalationsanästhesie kann eine injizierbare Anästhesie verwendet werden. Präoperatives Fasten ist nicht notwendig.
4. Laparotomie
- Mit sterilen chirurgischen Instrumenten wird ein 1,5 cm langer Schnitt in die Haut etwa 1 cm links lateral von der Mittellinie vorgenommen.
- Machen Sie einen 1,5 cm langen Schnitt in den darunter liegenden Bauchmuskel.
- Lokalisieren Sie die Milz mit der Pinzette und entfernen Sie die Milz vorsichtig aus der Bauchhöhle. Befestigen Sie die Milz an einem sterilen Wattestäbchen, um die darunter liegende Bauchspeicheldrüse freizulegen.
- Lokalisiere den Schwanz der Bauchspeicheldrüse neben der Milz.
- Injizieren Sie mit einer 29 g 0,3 ml Insulinspritze 20 μl der Matrigel-Zellsuspension in die Bauchspeicheldrüse.
- Halten Sie die Spritze nach der Injektion 30-60 Sekunden lang in der Bauchspeicheldrüse, bis sich das Matrigel verfestigt hat. Dieser wichtige Schritt minimiert das Auslaufen von Zellen.
- Überprüfen Sie die Injektionsstelle, um sicherzustellen, dass keine Leckage aufgetreten ist.
- Bringen Sie Milz und Bauchspeicheldrüse wieder in die Bauchhöhle zurück.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die dorsale Seite der Bauchspeicheldrüse nicht durchstochen wird, die dünn sein kann.
5. Verschluss der Bauchdecke
- Verschließen Sie die Bauchmuskulatur der Maus mit einer resorbierbaren, geflochtenen 4-0-Naht mit einer Rundnadel mit einem durchgehenden Stich.
- Verschließen Sie die Außenhaut mit einem nicht resorbierbaren monofilen Nahtmaterial 6-0 mit einer Schneidenadel mit einem Endlosstich.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Inhalationsanästhetikum und injizieren Sie 0,05-0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan.
- Lassen Sie die Maus sich in ihrem Käfig erholen, der auf einem 37 °C warmen Heizkissen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser steht. Wenn Mäuse Anzeichen von Schmerzen wie Buckeln oder eingeschränkter Beweglichkeit zeigen, kann Buprenorphin über einen Zeitraum von 36 Stunden alle 12 Stunden verabreicht werden.
- Nach der Wundheilung (7-10 Tage) betäuben Sie die Maus und entfernen Sie die äußeren Nähte.
6. Biolumineszierende Verfolgung des Fortschreitens von Bauchspeicheldrüsenkrebs
- Betäuben Sie die Maus mit inhalativem Isofluran.
- 150 mg/kg D-Luciferin über die Schwanzvene injizieren.
- Platzieren Sie die Maus in dem biolumineszierenden Bildgebungssystem und nehmen Sie Weißlicht- und Biolumineszenzbilder auf.
- Nehmen Sie die Maus aus dem Inhalationsnarkosemittel und lassen Sie sie sich in ihrem Heimkäfig erholen.
HINWEIS: Die biolumineszierende Bildgebung ist nicht-invasiv und kann regelmäßig durchgeführt werden, um die Kinetik des Tumorwachstums zu untersuchen. Um einen Tumor im Pankreasschwanz abzubilden, ist es wichtig, die Maus auf die linke Seite zu legen, so dass der Tumor in Richtung Kamera zeigt. Wir haben einmal pro Woche mit einer bis zu dreimal pro Woche erhöhten Häufigkeit vor dem experimentellen Endpunkt mit einem Lumina II-Bildgebungssystem (Perkin-Elmer, ehemals Caliper Life Sciences) mit der Living Imaging 4.3.1-Software mit Binning 4, FOV 12,5, Blende 1, Belichtung 1 - 60 Sekunden (bestimmt durch die höchste Belichtung ohne Pixelsättigung ) aufgenommen.
