Patienten-abgeleitete Xenotransplantat-Modellierung: Eine Technik zur Generierung von Melanom-Mausmodellen

Zusammenfassung

Quelle: Min Xiao et al. Ein von Melanompatienten abgeleitetes Xenotransplantat-Modell. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video werden vom Menschen stammende Melanomzellen subkutan in die Flankenregion einer immungeschwächten Maus implantiert. Das PDX-Modell ermöglicht die präklinische Untersuchung von Melanomzellen, die die in vivo beobachtete Tumorheterogenität und Melanomaggressivität besser rekapitulieren.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Verarbeitung von Tumorgewebe für die Implantation von Mäusen

1. Chirurgische Exzision oder chirurgische Biopsie-Gewebeaufbereitung
   1. Übertragen Sie das Gewebe in eine sterile Petrischale und trennen Sie das Tumorgewebe so weit wie möglich vom umgebenden Normalgewebe.
   2. Entfernen Sie nekrotisches Gewebe (normalerweise als blass-weißliches Gewebe identifiziert, das sich zentral im Tumor befindet) so weit wie möglich aus dem verbleibenden Tumor
   .
   3. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen anfänglichen Tumorblock in ungefähr gleiche Stücke (~3 mm x 3 mm) für die chirurgische Mausimplantation zu unterteilen (Abbildung 1).
   4. Wenn genügend Tumorgewebe zur Verfügung steht, kann das Gewebe optional für nachgelagerte Assays (RNA-Sequenzierung [RNASeq], Whole-Exom-Sequenzierung [WES] usw.) eingefroren werden.
   5. Stellen Sie eine Tumoraufschlämmung her, indem Sie das Tumorgewebe mit einer Kreuzklingentechnik mit zwei Skalpellklingen zerkleinern. Zerkleinern Sie die Tumorbrocken so fein wie möglich, um eine Aufschlämmung zu bilden, die nun für die chirurgische Mausimplantation bereit ist.
   6. Wenn das Tumorgewebe für die mechanische Dissoziation zu hart ist, kann alternativ ein Verdauungsdissoziationsverfahren verwendet werden, um eine gelartige Aufschlämmung und eine einzellige Suspension für die Implantation und/oder Injektion zu bilden.
      1. Zerkleinern Sie die Tumorbrocken so fein wie möglich, um eine Aufschlämmung zu bilden.
      2. Geben Sie die Gülle in ein 50-ml-Röhrchen mit kalter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)^-/- (ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺) und zentrifugieren Sie dann das Pellet bei 220 x g für 4 min bei 4 °C.
      3. Resuspendieren Sie die Aufschlämmung in 10 mL erwärmtem frischem Aufschlussmedium (200 U/mL Kollagenase IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U/mL DNase in HBSS^-/-) pro 1 g Tumorgewebe.
      4. Legen Sie das Röhrchen für 20 min in ein 37 °C heißes Wasserbad und mischen Sie es alle 5 min kräftig mit einer Einwegpipette.
      5. Mit bis zu 50 mL ^HBSS-/- waschen, dann bei 220 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugieren.
      6. 5 ml vorgewärmtes TEG (0,025 % Trypsin + 40 μg/ml Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure [EGTA] + 10 μg/ml Polyvinylalkohol [PVA]) pro 1 g Tumorgewebe zugeben, vorsichtig resuspendieren/schütteln und das Röhrchen 2 Minuten lang ohne Mischen bei 37 °C aufstellen.
      7. Mindestens 1 gleiches Volumen Kaltfärbemedium (1 % Rinderserumalbumin [BSA] + 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure [HEPES] + 1x Penicillin-Streptomycin in L15-Medien) zum Abschrecken des Trypsins zugeben und bei 220 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugieren.
      8. Die Probe wird in 10 ml Färbemedium pro 1 g Tumorgewebe resuspendiert und durch ein 40-μm-Zellsieb filtriert, um eine Einzelzellsuspension für die Mausinjektion zu erhalten (Abbildung 1).
      9. Die auf dem Zellsieb verbleibende Aufschlämmung kann auch für die chirurgische Mausimplantation aufgefangen werden.
2. Tumorimplantation und -injektion bei Mäusen
   1. Implantation von chirurgischer Exzision oder chirurgischer Biopsie
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente steril sind, indem Sie sie autoklavieren oder vorsterilisierte Einweginstrumente verwenden.
      1. Rasieren Sie Haare vom unteren Rücken von männlichen oder weiblichen NSG-Mäusen mit 6-8 Wochen und lassen Sie einen Bereich von etwa 1,5 cm x 3 cm ohne Haare. Betäuben Sie Mäuse mit Isofluran und bestätigen Sie, indem Sie den Fuß sanft zusammendrücken, um die Reaktionsfähigkeit zu testen. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit zu vermeiden.
      2. Legen Sie einzelne Mäuse auf ein Wärmekissen im Nasenkonus des Anästhesiegeräts, schrubben Sie die rasierte Stelle mit Chlorhexidin. Dann mit 70% Ethanol übergießen und verdampfen lassen.
      3. Bereiten Sie Brocken vor oder teilen Sie die Tumoraufschlämmung in einer Petrischale in einzelne Hügel für die chirurgische Implantation (d. h. in drei gleiche Hügel, wenn sie in 3 Mäuse implantiert werden sollen).
      4. Machen Sie mit der Skalpellklinge einen ca. 5 mm langen Schnitt in der Mitte des Rückens der Maus, nehmen Sie eine Pinzette und heben Sie die Haut auf der Seite des Schnitts an, die dem Bediener gegenüberliegt.
      5. Nehmen Sie die Schere in die andere Hand und trennen Sie die Haut von der Muskelschicht, indem Sie die Faszienmembran mit kleinen Scherenschnitten sanft durchtrennen und so eine "Tasche" für das Tumorgewebe schaffen.
      6. Nehmen Sie mit der Skalpellklinge einen Tumorbrocken oder einen einzelnen Hügel Tumorschlammgewebe auf und legen Sie das Gewebe vorsichtig in die entstandene Tasche.
      7. Verabreichen Sie 100 μl künstliche extrazelluläre Matrix auf den Tumorgewebshügel in der Tasche.
      8. Ziehen Sie den Schnitt mit zwei Pinzetten an beiden Enden nach oben, so dass die Wundränder nahe beieinander liegen, und schließen Sie die Wunde, indem Sie ein oder zwei Wundklammern anbringen.
      9. Subkutan injizieren Sie 1-5 mg/kg Meloxicam als Analgetikum bei Mäusen nach der Operation.
      10. Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel und setzen Sie sie wieder in ihren ursprünglichen Käfig ein; beobachten Sie die Maus beim Aufwachen. Kehren Sie nicht in einen Käfig zurück, bis Sie sich vollständig erholt haben.
      11. Entfernen Sie die Wundklammern nach ca. 7 Tagen. Wenn die Heilung nach 7 Tagen nicht abgeschlossen ist, lassen Sie den Wundclip noch ein bis zwei Tage einstecken.
          Anmerkung: Wenn eine Einzelzellsuspension aus einer chirurgischen Exzision oder chirurgischen Biopsie-Gewebeverarbeitung verwendet wird, wird sie mit künstlicher extrazellulärer Matrix (im Verhältnis 1:1) für die Injektion von Mäusen gemischt.
   2. Injektion von FNA- oder Kernbiopsiegewebe
      1. Stellen Sie eine NSG-Maus auf ein Stahlgitter, halten Sie die Maus fest am Schwanz, und ziehen Sie die Maus vorsichtig zurück. Er greift das Gitter mit den Vorderbeinen fest. Alternativ können Sie die Maus in der nicht-dominanten Hand halten und den Flankenbereich sichtbar lassen.
      2. Desinfizieren Sie die Haut der Flanke mit Alkoholvorbereitungstäbchen. Injizieren Sie den Inhalt der Spritze langsam und stetig unter die Haut der Maus.
      3. Ziehen Sie die Nadel heraus und setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein.
3. Überwachen Sie das Tumorwachstum
   1. Überwachen Sie Mäuse einmal wöchentlich, um nach tastbaren Tumoren zu suchen.
   2. Sobald die Tumore eine messbare Größe (ca. 50 mm³) erreicht haben, verwenden Sie einen Messschieber, um die Tumorabmessungen aufzuzeichnen. Verwenden Sie die folgende Formel, um das Tumorvolumen zu berechnen: (Breite x Breite x Länge) / 2.
   3. Entnehmen Sie den Tumor, sobald das Tumorvolumen etwa 1,5 cm³ (ca. 4-10 Wochen) erreicht. Der Tumor wird nun Mauspassage 1 (MP1) genannt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Alternative Implantationsmethoden.(A) Tumoren können entweder in Stücke, als Slurry-Suspension oder als Einzelzellsuspension verarbeitet werden. (B) Alle drei Methoden ermöglichen das Wachstum von Tumoren in vivo. Hier sind Mäuse zu sehen, denen subkutan ein Tumor implantiert und die 12 Tage nach der Implantation abgebildet wurden. (C...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Katze # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Katze # 15140163
1x HBSS-/- (ohne Ca++ oder Mg++)	medizinisch	Kat # MT21-023-CV
2,5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Katze # T4549-100ML	10 mL Aliquots, gelagert bei –20 oC
Bsa	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Katze # A9418-500G
chlorhexidin	Fisher Scientific	Kat# 50-118-0313
Kollagenase IV (2.000 μu/ml)	Worthington	Katze #4189	Make-up in HBSS-/- aus Collagenase IV Pulvervorrat (Worthington #4189, u/mg auf der Flasche angegeben und variiert je nach Charge); einfrieren 1
Dmso	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Katze # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Kat # D4527
EGTA (Ethylenglykol, Bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N'-Tetraessigsäure)	Merck	Katze # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIEN	Katze # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIEN	Katze # 15290-018
gentamicin	FISCHER WISSENSCHAFTLICH	Katze # BW17518Z
Isofluran	HENRY SCHEIN TIERGESUNDHEIT	Katze # 050031
Leibovitz' L15-Medien	Invitrogen	Katze # 21083027
Matrigel	Corning	Katze # 354230	Künstliche extrazelluläre Matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Katze # 025115	1-5mg/kg, als Schmerzmittel
NOD/SCID/IL2-Rezeptor null (NSG) Mäuse	Das Wistar Institute, Tierheim		Züchtung
PVA (Polyvinylalkohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Katze # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X mit L-Glutamin	Fisher Scientific	Kat# MT10041CM
Skalpell	Feder	Katze # 2976-22
Gewickelte Klammern	Mikron	Katze #427631