Dieser Artikel wird detailliert die Verfahren zur Messung der Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie.
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Methodenartikel
Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Calpaine sind allgegenwärtig intrazellulären Calcium-sensitiven, neutral Cystein-Proteasen
Protokoll
Bereiten Sie Reagenzien
Hinweis: Alle PBS enthält Ca 2 + und Mg 2 +
- Nachweisreagenz
Add 20 um 7-Amino-4-chlormethyl Cumarin, t-BOC-Leucin-methioninamid (BOC-LM-CMAC) auf Raumtemperatur PBS. Jede Zellsuspension erfordert 2mL Nachweisreagenz. - 1% Paraformaldehyd (Fixed Cells)
Verdünnen Sie 4% Paraformaldehyd Stammlösung bei Raumtemperatur PBS. Aliquot 1ml 1% Paraformaldehyd jedem FACS-Röhrchen. Drei FACS Röhrchen für jede experimentelle Bedingung erforderlich sind (zB 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 brauchen 9 FACS-Röhrchen) - PD150606 (Calpain-Inhibitor)
Rekonstit....
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Diskussion
Die Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen 32Dkit hat in diesem Video-Protokoll bestimmt. Die Behandlung der Zelllinie mit dem Calpain-Inhibitor PD150606 führte zu einer vollständigen Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. Darüber hinaus führte die Behandlung mit dem Inhibitor PD98059 MEK1 in eine vollständige Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. ERK ist ein wichtiger Aktivator von Calpain-2 3. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Calpain-2-Aktivität überwiegt in der 32Dkit Zellen ist. .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Unterstützt durch Zuschüsse aus dem Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society of Canada und der Lymphoma Foundation of Canada.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4 % Paraformaldehyd | Invitrogen | 4 g Paraformaldehyd in 100 mL PBS lösen. Probe im Abzug unter Rühren erhitzen, bis sie klar ist. Abkühlen lassen, dann bei 4 °C lagern°C | |
| PD150606 | Invitrogen | Verwenden Sie frisch rekonstituiertes PD150606 für eine maximale Calpain-Hemmung. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluoreszierende Kügelchen FACS-Röhrchen | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | Das Überstandmedium von WEHI-3-Zellen wird in diesen Experimenten als Quelle für IL-3 verwendet. Jede Überstandsammlung von WEHI-3 wird titriert, um die optimale Konzentration für das Wachstum von 32Dkit-Zellen zu bestimmen. |
Referenzen
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
