Targeting von Deep Brain Strukturen mit Mikroinjektionen für die Lieferung von Drogen, virale Vektoren oder Zelltransplantaten

Summary

In diesem Artikel zeigen wir eine Methode zur Glaskapillare Nadeln mit einem 50-um Lumen zu machen. Diese Technik reduziert die Schädigungen des Gehirns, minimiert passive Verbreitung von Drogen und ermöglicht eine genaue Ausrichtung in die Nager Gehirn.

Abstract

Mikroinjektionen in das Hirnparenchym sind wichtige Verfahren, die Drogen, virale Vektoren oder Zelltransplantaten liefern. Die Hirnverletzung, dass eine Injektionsnadel produziert während ihrer Flugbahn ist ein wichtiges Anliegen vor allem im Gehirn der Maus nicht nur für das Gehirn ist klein, aber manchmal auch mehrere Injektionen erforderlich sind. Wir zeigen hier eine Methode zur Glaskapillare Nadeln mit einem 50-Lumen um die erheblich reduziert die Hirnschäden und ermöglicht eine genaue Ausrichtung in die Nager Gehirn zu produzieren. Diese Methode erlaubt eine Lieferung von kleinen Mengen (20 bis 100 nl), reduziert Blutungen Risiken und minimiert passive Verbreitung von Drogen in das Hirnparenchym. Durch die Verwendung unterschiedlicher Größe der Kapillare Glasröhren oder dem Wechseln der Nadel Lumen, können verschiedene Arten von Substanzen und Zellen injiziert werden. Mikroinjektionen mit einer Glaskapillare eine erhebliche Verbesserung in Injektionstechniken und Tiefenhirnstimulation Targeting mit minimalen Kollateralschäden in kleinen Nagern.

Protocol

1. Machen Glasnadeln bevor Maus-Chirurgie:
   1. Legen Sie die Glaskapillare in einer Mikropipette Abzieher.
   2. Erhitzen Sie die Mitte des Glasrohres mit dem Glasrohr in der lokalisierten Bereich zu erweichen.
   3. Stretch das Glasrohr entlang seiner Längsachse durch eine anfängliche Abstand ausreicht, um eine Reduzierung der Durchmesser der Glasröhre in der lokalisierten Bereich verursachen.
   4. Halten Dehnung der Glasröhre, bis er bricht. Auf diese Weise sind zwei identische Single Barrel Nadeln erhalten.
2. Setzen Sie das Glas Nadel im microforge. Ein Winkel von 30 ° reicht zur Abschrägung der Spitze.
3. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass jeder Nadel die richtige innere Durchmesser hat. Für die meisten der hydrophilen Medikamenten eine 30-50 um Innendurchmesser ist ideal (Abbildung 1).
4. Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl von der breitesten Ende Glasnadel. Lassen Sie das Mineralöl (MSDS, Cat. M7700) tritt durch Kapillarwirkung, bis es ~ 50% der Länge der Kapillare erreicht. Put Hochvakuum-Fett (Dow Corning, Cat. 05054-AB) um den Kolben, um die weiteste Ende der Nadel zu versiegeln.
5. Legen Sie den Kolben durch den breitesten Ende der Nadel und drücken Sie vorsichtig Mineralöl, bis ein kleiner Tropfen Öl gesehen geht aus der Spitze des Glases Nadel.
6. Sichern Sie die Glasnadel in der Inhaber der Mikroinjektor.
7. Anesthetize der Maus mit 2,5% Avertin (2,2,2-Tribromethanol + tert-Amylalkohol, 1:1 w / v). Dosis 25-30μL pro Gramm intraperitoneal.
8. Legen Sie eine Heizung Pad auf der stereotaktischen Gerät Tier seine Körpertemperatur auf 37 ° C zu halten
9. Ort und sichern die Maus den Kopf in den stereotaktischen Gerät mit Ohr Bars und ein Zähnen Inhaber.
10. Reinigen Sie die Maus Kopf mit 0,1% Chlorhexidingluconat-Lösung, um 70% Ethanol und 0,1% Chlorhexidingluconat ein zweites Mal an.
11. Inzision der Haut mit einem Skalpell Nr. 15 von Maus-Ohren, die Lamba Schädel Linie.
12. Polnische den Schädel mit einem Wattestäbchen zu trocknen und ziehen Haut aus dem OP-Feld.
13. Verwenden Sie die Spitze des Glases Nadel an der Spitze des Bregma Naht Punkt. Dort haben Sie die Ausgangsposition der Injektor (die Koordinate "Null") gesetzt.
14. Stellen Sie den Punkt, indem Sie den "X" und "Y" Achse des stereotaktischen Gerät über den Schädel gebohrt werden.
15. Drill sehr vorsichtig Löcher an den ausgewählten koordinieren. Mikrobohrer und andere Werkzeuge aus Metall waren zuvor bei 250 ° C sterilisiert für 60 Sekunden mit einem trockenen Glasperlen Sterilisator (Cole Palmer, Cat. Nr. EW-10779-00).
16. Mit feinen Pinzette vorsichtig die tiefste Schicht des Knochens und brechen die duramatter Membran (Sie werden einige Rückenmarksflüssigkeit Austreten zu sehen).
17. Bestätigen Sie, dass die Nadel durch Bohrungen zu gehen.
18. Pipette 1 ul des Medikaments Sie injizieren und legte sie auf ein kleines Stück Parafilm.
19. Setzen Sie den Parafilm auf den Schädel.
20. Saugen bis das Medikament durch das Drehen der Mikroinjektor Rad, während Sie überprüfen unter dem Mikroskop, dass die Flüssigkeit wird bis in das Glas Nadel.
21. Entfernen Sie den Parafilm und re-set die Null zu koordinieren.
22. Bewegen Sie die Nadel auf die ausgewählten Koordinaten, auf der Halterung, bis die Spitze aus Glas Nadel sanft berühren der Hirnoberfläche und stellen Sie die "Z" zu koordinieren bei Null.
23. Führen Sie das Glas Nadel in das Gehirngewebe an ausgewählten Tiefe.
24. Spritzen Sie das Medikament langsam mit einer Geschwindigkeit von ca. 1 nl / sec.
25. Wenn das Begehren Volumen eingespritzt wird, lassen Sie das Medikament diffundieren in das Parenchym für 2 min. Dann fahren Sie mit der Nadel langsam und gleichmäßig zu entfernen.
26. Kleben Sie die OP-Wunde und entfernen Sie das Tier aus der stereotaktischen Gerät und setzte das Tier in einer vorgewärmten Käfig mit einem sauberen Bett zur Narkose Erholung.
27. Um die postoperative Analgesie alle Tiere erhielten 5 mg / kg subkutan Ketorolac jedem 12-Stunden für 24 h.

Repräsentative Ergebnisse:

Wenn nach diesem Protokoll ist eine sehr präzise Einspritzung erhalten und eine sehr enge Nadelbahn minimiert Hirn-Trauma. Als ein repräsentatives Ergebnis dieser Methode, injizierten wir Lysophosphatidylcholin (Lysolecithin) in das Corpus Callosum, dass Demyelinisierung der weißen Substanz Bahnen 1-4 produziert. Zur Minimierung der Hirnschädigung durch die Glasnadel produziert, injizierten wir nur 20 nl von Lysolecithin in das Corpus Callosum, sondern bei Bedarf höhere Volumina so viel wie 200 nl kann mit der gleichen Methode injiziert werden. Demyelinisierung wird durch die Abwesenheit von Myelin basisches Protein-Expression in der weißen Substanz (Abb. 2) nachgewiesen werden.

Abbildung 1. Ein Glas Nadel mit einem 50-Mikrometer Durchmesser. Abstand zwischen zwei kurzen Zeckenin der Skala repräsentiert ein 50-um Länge.

Abbildung 2. Lysolecithin Injektion in den Corpus Callosum. Demyelinisierung wird als nicht Myelin basisches Protein-Expression (gepunktete Fläche) dargestellt. Beachten Sie die geringe Größe der Glas-Stichkanal (Pfeile). Bar = 100 pm

Discussion

Die Methode zeigte in diesem Video ist sehr nützlich für die meisten Medikamente oder viralen Vektoren in sehr genauen Orte in das Gehirn liefern. Einige der wichtigsten Vorteile dieser Technik sind die Zuverlässigkeit der Targeting-Punkt, die Richtigkeit der Injektionen und die geringe Größe der Hirnschädigung und Darm-Trakt Schaden ^{1, 2, 5, 6.} Sobald die Technik ist standardisiert Bereich von mistargeting sollte 50 um oder weniger ^{1, 2.} Zelltransplantate kann auch mit weiteren, 100-150 um ^7-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kapillarglasrohr	Wiretrol I	5-000-1001
Mikropipettenabzieher	Kopf Instruments	Modell 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Modell 48000
Mineralöl	MSDS	M7700
Hochvakuumfett	Dow Corning	05054-AB
Anästhesie: 2,5% Avertin			2,2,2-tribrom– thanol + tert-amylalkohol, 1:1 w/v
Heizkissen	Mastex	Modell 900
Stereotaktisches Gerät	Kopf Instruments	Modell Kopf-900
Chirurgische Skalpellklinge # 15	Medi-Cut
Micro	Driller Ideal Micro Drill	67-1000
Feine Pinzette	Fine Science Tools
1-μ L Mikropipette	Rainin
Parafilm M.
Operationsmikroskop	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop mit Contraves System
Mikroinjektor	Narishige International	Modell MO-10