Dieses Protokoll verwendet einen Pull-Down-Assay auf das Niveau der aktiven RhoC GTPase innerhalb der Zellen zu bestimmen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
RhoC GTPase hat 91% Homologie zu RhoA GTPase. Aufgrund der Prävalenz in den Zellen haben viele Reagenzien und Techniken für RhoA GTPase entwickelt worden. Allerdings ist RhoC GTPase in metastasierenden Krebszellen auf relativ niedrigem Niveau exprimiert. Deshalb haben einige RhoC-spezifische Reagenzien entwickelt worden. Wir haben eine Rho-Aktivierungs-Assay angepasst RhoC GTPase zu erkennen. Diese Technik nutzt eine GST-Rho-bindende Domäne Fusionsprotein herausziehen aktive RhoC GTPase. Darüber hinaus können wir insgesamt Protein zu Beginn des Tests Ernte auf ein Niveau von insgesamt (GTP und GDP gebunden) RhoC GTPase zu bestimmen. Dies ermöglicht die Bestimmung des aktiven und totale RhoC GTPase in der Zelle. Mehrere kommerzielle Versionen von diesem Verfahren wurden jedoch entwickelt, sind die kommerziellen Kits für RhoA GTPase optimiert und in der Regel nicht gut für RhoC GTPase. Teile des Tests wurden ebenso wie die Entwicklung eines RhoC-spezifischen Antikörper modifiziert.
Protokoll
1. Bereiten Sie GST-Fusionsprotein
- Glycerol Bestände JM109 kompetente Bakterien mit den ersten N-terminalen 90 Aminosäuren des rhotekin Rho-Bindungsdomäne (RBD) in die BamH1/EcoR1 pGEX3x subkloniert sind.
Um eine hohe Effizienz der folgenden Schritte müssen für jedes Experiment durchgeführt werden. In unserer Erfahrung, frisch zubereitete GST-RBD ist der Schlüssel, um eine robuste und präzise GTPase-Aktivierungs-Assay. - Dann werden 50 ul (ungefähre, nicht auftauen) Glycerin Lager, um 50 ml LB amp und wachsen 37 ° C über Nacht unter Schütteln.
- Verdünnen 1:10 in 500 ml LB-Amp und wachsen für 1 h.
- Induce GST-Protein-Produ....
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Diskussion
Der wichtigste Schritt des Verfahrens ist die Erzeugung von frischen GST-RBD. Andernfalls Aufmerksamkeit, um diesen Schritt zu zahlen ist Hauptgrund für das Scheitern. Alle Schritte, von der Generation der GST-RBD (1,2), die Inkubation über Nacht mit dem Zelllysat (2,5), sollte an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Ein weiterer entscheidender Schritt ist, um sicherzustellen, dass es genügend Zellen zu den Zelllysaten zu produzieren. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn man RhoC GTPase, die anwesend zu sein in ge.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
US-Verteidigungsministerium W81XWH-05-1 bis 0005, W81XWH-06-1 bis 0495, W81XWH-08-1 bis 0029 und W81XWH-08-1 bis 0356
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Kriterium-4-20 %-Tris-HCl-Gele | Bio-Rad | 345-0032 |
Referenzen
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
