Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Summary

Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden kann In-vitro- Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher nachzubessern.

Abstract

Tissue Steifigkeit ist eine wichtige Determinante für zelluläre Funktion und Veränderungen im Gewebe Steifigkeit sind häufig mit Fibrose, Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankung ^1-11 verbunden. Traditionelle zellbiologische Ansätze zum Studium zellulärer Funktionen werden Zellkulturen auf einem starren Substrat (Plastikschalen oder Deckgläschen), die nicht für die Wirkung eines elastischen ECM oder die Variationen in ECM Steifigkeit zwischen Geweben erklären kann. Zur Modellierung in vivo Tissue Compliance-Bedingungen in vitro, verwenden wir und andere ECM-beschichteten Hydrogele. In unserem Labor werden die Hydrogele auf Polyacrylamid, die den Bereich des Tissue Verstöße gesehen biologisch ¹² nachahmen kann basieren. "Reaktive" Deckgläser werden durch Inkubation mit NaOH durch Zugabe von 3-APTMS gefolgt generiert. Glutaraldehyd wird verwendet, um Vernetzung der 3-APTMS und das Polyacrylamidgel. Eine Lösung von Acrylamid (AC), Bis-Acrylamid (Bis-AC) und Ammoniumpersulfat ist für die Polymerisation des Hydrogels verwendet. N-Hydroxysuccinimid (NHS) in den AC-Lösung zur Vernetzung von ECM-Protein auf das Hydrogel eingebaut. Nach der Polymerisation des Hydrogels wird das Gel Oberfläche mit einer ECM-Protein der Wahl, wie Fibronektin, Vitronektin, Kollagen, etc. beschichtet

Die Steifigkeit eines Hydrogels kann durch Rheologie oder Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestimmt und angepasst werden durch Variation der Anteil der AC-und / oder Bis-AC in der Lösung ^12. Auf diese Weise können Substrat Steifigkeit, um die Steifigkeit von biologischen Geweben, die auch quantifiziert werden mit Hilfe der Rheologie oder AFM abgestimmt werden. Die Zellen können dann auf dieser Hydrogele und kultiviert auf die experimentellen Voraussetzungen basiert ausgesät werden. Imaging der Zellen und ihre Genesung für die molekulare Analyse ist einfach. Für diesen Artikel definieren wir weichen Substraten, wie solche mit Elastizitätsmoduln (E) <3000 Pascal und steife Substrate / Gewebe wie die mit E> 20.000 Pascal.

Protocol

Vorbereitung

• Deckgläser sollten autoklaviert werden.
• Sterile Zugabe von destilliertem Wasser sollte verwendet werden, um Lösungen vorzubereiten und für das Waschen Deckgläser werden.
• AC (40% w / v) und Bis-AC (1% w / v)-Lösungen werden von 0,2 mu m sterilfiltriert. Bereiten Sie 10% Ammoniumpersulfat (APS; 100μg/ml Wasser) kurz vor dem Gebrauch und Sterilfilter. Ersetzen Sie die APS-Lösung monatlich.
• Chemische Reagenzien wie 3-APTMS, Chloroform, glutaradehyde, NHS und SurfaSil, die nicht zu autoklaviert werden in einem zugewiesenen Flasche ausschließlich für die Herstellung von Hydrogelen verwendet gehalten.
• Für beste....

Discussion

Ein entscheidendes Element des Hydrogels Polymerisation wird die Luft Blasenbildung, die es Zellen, die Deckglas, anstatt die ECM-beschichteten Hydrogel sich binden zu vermeiden. Dies kann durch vorsichtiges Pipettieren der Polymerisationslösung nach Vortexen und visuell darauf achten, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden in das Gel verhindert werden. Wir empfehlen immer, bereitet zusätzliche "reaktiven" Deckgläser und Hydrogele, um sicherzustellen, dass genug für Experimente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyd, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Bei -20° lagern; C
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilan 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Bei Raumtemperatur lagern
SurfaSil Silikonisierungsflüssigkeit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Bei Raumtemperatur
lagern NHS (N-Hydroxysucinimidester)	Sigma-Aldrich	A-8060	Bei 4° C Monatliches
Albumin ersetzen, Rinderserum, im Wesentlichen fettsäurefrei	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Bei 4° C
Deckgläser (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Deckgläser (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D