Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Eine robuste Methode zur Quantifizierung von fluoreszenzmarkierten und derivatisierten Sialinsäuren, die aus Mausleber isoliert wurden
In diesem Video demonstrieren wir den Nachweis von Sialinsäuren, N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylneuraminsäure unter Verwendung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, HPLC, nach der Derivatisierung mit einem geeigneten Fluoreszenzmarkierungsreagenz zur Unterstützung der Fluoreszenzdetektion.
Protocol
1. Fluoreszenzderivatisierung von Sialinsäuren
Bereiten Sie 10 ml OPD-Lösung vor, bestehend aus 100 mg o-Phenylendiamin und 208 mg Natriumhydrogensulfit in 10 ml destilliertem H₂O.
Geben Sie 20 μl OPD-Lösung zu den Sialinsäureproben. 30 s lang kräftig vortexen und die Proben 4 h bei 80 °C im Dunkeln inkubieren (d. h. die Mikroröhrchen in Alufolie einwickeln).
Lassen Sie die Proben 5 min abkühlen, fügen Sie 80 μL destilliertes H₂O hinzu und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 x g für 1 min.
Übertragen Sie 80 μl aus dem Überstand in ein 300 μl HPLC-Fläschchen mit hoher Rückgewinnung. Die derivatisierten Sialinsäure-Proben können bis zu einer Woche bei 4-6 °C gelagert werden.
2. HPLC-Analyse von Sialinsäurederivaten
Analysieren Sie die Proben mit einem Standard-HPLC-System, das mit einem Online-Fluoreszenzdetektor verbunden ist.
Verwenden Sie für die Analyse eine Umkehrphasensäule C18 mit den Standardabmessungen von 250 mm Länge und 4,6 mm Durchmesser.
Bereiten Sie Lösungsmittel A vor, indem Sie 200 mL Stammlösung mit 800 mL Wasser in LCMS-Qualität (LCMS – Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie) verdünnen. Die Stammlösung selbst kann wie folgt hergestellt werden:
Fügen Sie 46 g Ameisensäure zu 800 ml H₂O in LCMS-Qualität hinzu.
Stellen Sie den pH-Wert auf 4,5 ein, indem Sie tropfenweise Ammoniumhydroxidlösung (puriss. p.a.) hinzufügen.
Füllen Sie das Lösungsmittel in einen Messzylinder und füllen Sie bis zu 1.000 mL mit H₂O in LCMS-Qualität. Diese Stammlösung kann bis zu 3 Monate bei 4-6 °C gelagert werden.
Verwenden Sie für Lösungsmittel B Acetonitril in LCMS-Qualität.
Trennen Sie die Sialinsäurederivate bei einer Flussrate von 1 ml/min mit der folgenden Gradientenelution:
Beginnen Sie mit der Zugabe von 10 % Lösungsmittel B gemischt zu Lösungsmittel A.
Erhöhen Sie von 0 min bis 15 min allmählich den Anteil von Lösungsmittel B mit einem linearen Gradienten auf 60%.
Erhöhen Sie den Anteil von Lösungsmittel B mit einem linearen Gradienten von 15 min auf 16 min schnell von 60 % auf 90 %. Dadurch wird das Waschen der HPLC-Säule eingeleitet.
Um die HPLC-Säule weiter zu waschen, halten Sie den Gehalt an Lösungsmittel B zwischen 16 min und 18 min bei 90 %, bevor Sie den Gehalt an Lösungsmittel B zwischen 18 min und 19 min wieder auf 10 % reduzieren.
Die
HPLC-Säule zwischen 19 und 24 min wieder auf die Startbedingungen von 10% B ausbalancieren.
Injizieren Sie 50 μl Probe in das HPLC-System.
Überwachen Sie Eluenten mit den Anregungs-/Emissionswellenlängen des Fluoreszenzdetektors von 373/448 nm, und die derivatisierten Sialinsäuren können bei den ungefähren Retentionszeiten von 9 min (für Neu5Gc-OPD) und 10 min (für Neu5Ac-OPD) erwartet werden.
Berechnen Sie die relative Menge an Neu5Gc (FNeu5Gc) aus den Fluoreszenzpeakflächen von Neu5Ac (ANeu5Ac) und Neu5Gc (ANeu5Gc) wie folgt:
FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). Im Falle der Milch- und Leberproben der homozygoten Cmah-Knock-out-Maus FNeu5Gc sollte 0 % betragen, während die Werte für FNeu5Gc von heterozygoten und Wildtyp-Mäusen je nach Alter und Gewebetyp der Maus stark variieren können (zwischen 2 % und >90 %) mit erwarteten Fehlermargen von ±12 %).
Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography: A Robust Method for Quantitation of Fluorescently Labeled and Derivatized Sialic Acids Isolated from Mouse Liver. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21100, doi: (2025).