Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Amplikons nach der PCR: Eine Methode zur Analyse von Produkten der Multiplex-PCR und zur Bewertung des Erfolgs von PCR-Reaktionen
Published: April 30, 2023
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Abstract
Quelle: Gulla, S. et al. Multi-Locus Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019)
In diesem Video demonstrieren wir die Trennung von bakterieller PCR-amplifizierter DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese. Agarose-Gel fungiert als molekulares Sieb, das es der negativ geladenen DNA ermöglicht, basierend auf ihrer Größe unter einem angelegten elektrischen Feld zu wandern.
Protocol
<p class="jove_title">1. PCR-Amplikon-Bestätigung durch Gelelektrophorese
- Bereiten Sie gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein Volumen von 1,5 % (w/v) Agarosegel in 1x Tris-Borat-EDTA (FSME)-Puffer her, das für die Anzahl der zu testenden PCR-Reaktionen geeignet ist. Vor dem Gießen 5 μl fluoreszierender Nukleinsäurefarbstoff pro 50 μl Gellösung hinzufügen und mischen. Verwenden Sie für das Gießen Schalen und Kämme und lassen Sie eine angemessene Anzahl von Vertiefungen für DNA-Referenzleitern frei.
- Nach dem Abbinden das Gel in 1x FSME-Puffer in ein GE-System tauchen. Mischen Sie 5 μl PCR-Produkt mit 2 μl Ladefarbstoff und geben Sie es in die Gel-Wells. Fügen Sie 5 μl DNA-Leiter in leere Vertiefungen als Referenz hinzu.
- Lassen Sie das Gel ca. 1 h lang bei 110 V pro 15 cm laufen und verwenden Sie ein UV-basiertes Gel-Bildgebungs-/Visualisierungssystem, um das Vorhandensein mehrerer (bis zu fünf) Banden zu überprüfen, die PCR-Amplikons darstellen (siehe Beispiel in Abbildung 1). Entsorge das Gel. Lagern Sie die restlichen PCR-Produkte bis zur Weiterverarbeitung bei 4 °C.
Representative Results
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Gel electrophoresis system | As preferred | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred | NA |
Cite This Article
Agarose Gel Electrophoresis of DNA Amplicons Post PCR: A Method to Analyze Products of Multiplex PCR and Evaluate PCR Reaction Success. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21112, doi: (2025).