Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

Zusammenfassung

Wir beschreiben а Protokoll für die Isolierung von reinen, stark gekoppelte Ratte-Mitochondrien für funktionelle oder strukturelle Untersuchungen der zellulären Bioenergetik, biophysikalische Messungen, Proteomik oder mitochondriale DNA und Lipiden Analyse.

Zusammenfassung

Die Funktion der Mitochondrien bei der Erzeugung von zellulären ATP in den Prozess der oxidativen Phosphorylierung wird allgemein anerkannt. In den vergangenen Jahrzehnten gab es bedeutende Fortschritte in unserem Verständnis der Funktionen der Mitochondrien anderes als die Erzeugung von Energie worden. Dazu gehören ihre Rolle bei der Apoptose, als Signalisierung Organellen, Säugetieren und des Alterns sowie deren Beitrag zur Koordination zwischen den Zellstoffwechsel und die Zellproliferation. Unser Verständnis von biologischen Prozessen moduliert durch Mitochondrien ist auf robuste Methoden zur Isolierung und Behandlung von intakten Mitochondrien aus dem Gewebe der Versuchstiere auf. Mitochondrien aus Ratten-Herz ist eine der häufigsten Vorbereitungen für vergangene und aktuelle Studien des Zellstoffwechsels, einschließlich Studien zur Knock-out-Tiere.

Hier beschreiben wir eine detaillierte schnelle Methode zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung. Eine solche Vorbereitung von Ratten-Mitochondrien ist ein hervorragendes Objekt für funktionelle und strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Transport von Biomolekülen, Proteom-Studien und Analysen der mitochondrialen DNA, Proteine ​​und Lipide.

Protokoll

Einführung

Mitochondrien aus Ratten-Herz ist eine der häufigsten Vorbereitungen für vergangene und aktuelle Studien des Zellstoffwechsels. Sie können schnell und zuverlässig in großen Mengen gewonnen werden aus Wildtyp-oder Knock-out-Tiere. Das allgemeine Verfahren besteht aus Gewebe durch Trypsin, Fraktionierung und differentielle Zentrifugation.

Es gibt verschiedene Bedingungen, die bei der Isolierung von Mitochondrien aus verschiedenen Geweben gehalten werden, einschließlich des Herzens (Abb. 1).

• Das Gewebe muss gründlich zerkleinert werden, da sie direkten Einfluss auf die Ausbeute der erhaltenen Mitochondrien. Herzgewebe ist am besten mit kleinen gebogenen Schere Hackfleisch und kann durch einen Latapie Gewebe Mühle verfolgt werden oder, wenn ein Gewebe Mahlwerk nicht verfügbar ist, eine Knoblauchpresse mit Austrittslöchern Durchmesser von etwa 1,0 mm Durchmesser.
• Es ist notwendig, um die Temperatur der Lösungen bei jedem Schritt zu halten. Deshalb ist die gesamte Verfahren muss in einem kalten Raum und alle Instrumente durchgeführt werden und Lösungen bereit und gekühlt werden im Voraus. Wenn die Temperaturen nicht stabil gehalten werden mehrere Eigenschaften der Zubereitung verloren gehen kann. Mitochondriale Struktur ist sehr frostempfindlich so overfreezing der Suspension (zum Beispiel während der Zentrifugation) ist nicht zulässig, vor allem, wenn das Studium der aktiven Transport wichtig sind.
• Ein wichtiger Parameter ist die Zeit-Dauer des Verfahrens, die Trennung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden und das erhaltene Präparat muss sofort verwendet werden. Deshalb haben chirurgische Instrumente, Lösungen und Appliances im Voraus vorbereitet werden.

Materialien und Instrumente

Instruments

1. Gerade Betriebssystem Schere, scharfe Spitze
2. Gebogene Schere
3. Zange
4. Petrischale
5. Kleine Trichter + Stück Nylon-Filter (vorgewaschen)
6. 6 Bechergläser 50 ml
7. Zwei Magnetrührer und zwei Eisbäder
8. Ein großer Eisbad
9. 2 kleine magnetische Stäbe
10. Spatel für Pellet Schaben
11. Zentrifugenröhrchen
12. Latapie Gewebe drücken (mit Knoblauchpresse ersetzt werden)
13. Teflon-Glas-Homogenisatoren 20ml und 1-2ml
14. Waste Becher
15. Eppendorf-Röhrchen für die endgültige mitochondrialen Federung und Proben für die Proteinbestimmung
16. Ice Bäder

Solutions (berechnet pro 2 Ratten):

1. Waschpuffer: 0,3 M Sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)
2. Isolation Puffer: 0,3 M Sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma a6003) (100ml hergestellt aus den Waschpuffer). Rinderserumalbumin durch weniger teure Fettsäure-freien Analoga ersetzt werden. Die gleichen Puffer oder seine isotonische Varianten können als Resuspendieren Puffer verwendet werden.
3. Trypsin (Sigma T8003) Lösung: 2.5mg/ml in 1mM HCl (0,5 ml)
4. Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml Isolation Puffer

Protokoll

Das allgemeine Schema des Verfahrens ist in Abb. dargestellt. 1. Herz sollte gekühlt und gewaschen werden in Waschpuffer, ventrikuläre Gewebe herausgeschnitten, zerkleinert und homogenisiert während photolytische Behandlung mit Trypsin. Die Suspension wird bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird erneut mit einer höheren Geschwindigkeit zentrifugiert, um zu sammeln Mitochondrien. Abhängig von der geplanten Experimente der Resuspendieren Puffer kann von keinem anderen isotonischen Lösung ersetzt werden.

Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den britischen beendet "Animals (Scientific Procedures) Act." durch Genickbruch durch Enthauptung folgten. Es ist notwendig, das Herz sofort nach der Enthauptung des Tieres zu extrahieren, so dass es keine Verzögerung zwischen Tier Kündigung und Herz-Extraktion. Wenn die parallele Isolierung von Mitochondrien wird erwartet, dass die Ratten sollte über Nacht vor dem Experiment gefastet werden.

1. Drei Becher vorbereiten mit 40 ml Waschpuffer. Coole sie in das Eis-Salz-Bad für 3 bis 5 min, bevor Sie den nächsten Schritt. Achten Sie darauf, nicht zu ihnen overfreeze und sofort verwenden kurz nach Wolken aus Eiskristallen zu erscheinen beginnen.
2. Öffnen Sie den Brustkorb des enthaupteten Ratte und extrahieren Sie die Herzen. Machen Sie kleine Schnitte und dann sofort in die Herzen der eiskalten Lösung in den ersten Becher. Squeeze des Herzens, Blut zu entfernen und steckte es in das zweite Becherglas. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Herz.
3. Trocknen Sie die Herzen auf dem Filterpapier. Entfernen Sie alle Fett, geronnenes Blut, Ohrmuscheln und Faszien und Pool der ventrikulären Gewebe.
4. Mince der gepoolten Gewebe mit kleinen gebogenen Schere auf der Petrischale auf Eis für etwa 5 min bis die Größe der Partikel ist ca. 1-2 mm.
5. Legen Sie die zerkleinerten Gewebes in das Gewebe drücken und passes durch. Seien Sie sich bewusst, dass eine erhebliche Menge des Materials kann in der Presse bleiben so sammeln alle Herzgewebe von den Wänden und Boden der Presse.
6. Übertragung des Materials in das Becherglas mit 50 ml Waschpuffer und umrühren. Dann filtern Sie die Suspension durch einen Nylon-Filter. Waschen Sie die zerkleinerten Gewebes auf dem Filter 3 mal mit Waschpuffer und entsorgen das Filtrat.
7. Übertragen Sie die gewaschenen Gewebe in 20 ml Waschpuffer und legen Sie sie in das Eisbad auf den Magnetrührer. 0,5 ml Trypsin-Lösung unter ständigem Rühren und den Timer zu starten. Bereiten Sie eine andere Magnetrührer, Eisbad und einem zweiten 50-ml-Becher.
8. Am ^4. Minute kurz homogenisieren die Aussetzung portionsweise mit einem kleinen locker montiert Glas-Teflon-Homogenisator (10-15ml) mit mehreren und Abschlagen der Suspension zu verteilen. Nach der Homogenisierung Transfer der Suspension in das zweite Becherglas. Wiederholen Sie den Vorgang am ^9. Minute, so dass Sie die Homogenisierung der Suspension zweimal durchführen insgesamt. Nach 15 min Inkubation mit 10 ml isolieren Puffer mit Trypsin-Inhibitor und inkubieren für 1 min.
9. Filtern Sie die Suspension wieder durch einen Nylon-Filter, und speichern Sie das Filtrat. Sammeln Sie die Partikel-Fraktion auf einem Filter und homogenisieren für 1 min in 15-20 ml Waschpuffer links.
10. Kombinieren Sie das Homogenat mit dem Filtrat und Zentrifuge für 15 min bei 600g.
11. Sorgfältig Filter der resultierende Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie die Kontamination durch die Pellet-und Zentrifuge wieder für 15 min bei 8500G.
12. Nach Hochgeschwindigkeitszentrifugation den Überstand verwerfen und spülen Sie das Pellet 2-3 mal mit 1 ml des Puffers Verwerfen der flauschigen weißen Außenrand Schicht. Break up das Pellet mit dem Spatel, sondern um die roten Fleck der Erythrozyten an der Unterseite. Wenn die Blutzellen hat Loos, entfernen Sie die rote Bits aus der Suspension vor der Homogenisierung.
13. Das Pellet mit einem kleinen Homogenisator oder alternativ durch vorsichtiges Pipettieren. Die Suspension mit mehr Isolationbuffer und Zentrifuge wieder für 15 min bei 8500G.
14. Überstand verwerfen, das Pellet in Resuspendieren Buffer (einem isotonischen Puffer der Wahl) und Zentrifuge wieder.
15. Die resultierende braune Pellet enthält gewaschen intakten Mitochondrien. Das Pellet in einem sehr kleinen Volumen von isotonischen Puffer Ihrer Wahl.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritt für Schritt Verfahren der Isolierung von Ratten-Herzen Mitochondrien. Top Teil, Stages 1-9: Gewebeaufschluss, Trypsin-Behandlung und Homogenisierung; Unterteil, Stufen 10-15: differentielle Zentrifugation.

Diskussion

Detaillierte schnelle Protokoll zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung beschrieben. Erhalten Vorbereitung für eine funktionale oder strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Proteom-Studien oder Analysen der mitochondrialen DNA und Lipid-Gehalt verwendet werden. Biophysikalische Untersuchungen von aktiven Transport von Ionen und Stoffwechsel-Zwischenprodukte können auch durchgeführt werden. Es ist möglich, weitere Prozess der mitochondrialen Vorbereitung, um submitochondrialen Partikeln, äußere Membran oder Reinigung einzelnen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung zu isolieren. Das beschriebene Verfahren ist eine Modifikation des Standard-Protokoll der Isolation von Jacobus und Saks ^1. Die erwartete Rendite des präparierten Mitochondrien beträgt ca. 10-15 mg der mitochondrialen Protein pro Herzens und der Atmung kontrollieren Verhältnis auf Malat / Glutamat für diese Zubereitung variiert zwischen 8 bis 12 mit der staatlichen IV Atmung von rund 0,12 mmol O ₂ xmin ^-1 XMG Protein ^-1 bei 23 ° C in das Medium mit 0,25 M Saccharose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM Kaliumphosphat (pH 8,0) mit 150 uM ADP für die Einleitung Staat III Atmung (für die genauen experimentellen Bedingungen und Ergänzungen, siehe Lit. . ^2).

Besonderes Augenmerk sollte auf einige technische Details vor Beginn der Isolierung Verfahren gegeben werden. Es ist wichtig zu reinigen Polycarbonat oder Polypropylen-Zentrifugenröhrchen verwenden, also Röhren sollten gründlich mit einem sauberen Bürste und heißem Wasser, aber das Waschmittel sollte die Behandlung mit dem Minimum gehalten werden gewaschen werden. Außerdem ist es besser, alle notwendigen Glaswaren und Instrumente in den kalten Raum zu sammeln einen Tag vor der Isolation.

Während der Isolation bei der Übertragung von Puffern aus Flaschen zu Bechern, sollte а besonderes Augenmerk auf die Tropfen Eiswasser in die Lösungen zu verhindern. Beim Umgang mit Geweben es sollte betont werden, dass Herz-Extraktion sollte so bald wie möglich, da selbst kurze Zeitverzögerung zwischen Enthauptung des Tieres und Kühlung des Gewebes würde in teilweise abgekoppelt Mitochondrien Ergebnis durchgeführt werden. Schnelle Kühlung und gründliches Waschen der entfernt Herz ist von wesentlicher Bedeutung, um Standard-Vorbereitung, frei von Hämoglobin und Erythrozyten NADase erhalten.

Trypsin ist für Binde-Proteine ​​Abbau verwendet werden, um die Anfälligkeit des Gewebes auf Scherkraft Anstieg während der Homogenisierung. Längere Exposition des Gewebes Protease sollte vermieden werden, da es in den Mitochondrien von minderer Qualität führt werden.

Nach High-Speed-Zentrifugationen den Wänden der Röhrchen sollten mit Seidenpapier abgewischt werden, um Ablagerungen von Fett Material an den Wänden angesammelt entfernen.

Für die endgültige Resuspension ist es besser, ein geringes Volumen des fertigen Puffer zu nutzen, um Verluste zu minimieren der mitochondrialen Funktionen während der Lagerung (150 bis 200 ul des Puffers pro Herz). Für Untersuchungen der Transport von zweiwertigen Kationen keine Chelatbildner vorhanden sein muss in den letzten Vorbereitungen so Mitochondrien sollte mehrmals mit EGTA-freiem Medium gewaschen und verwendet werden, innerhalb der ersten Stunden nach der Trennung.