Dieser Artikel will in schrittweise beschreiben die gebräuchlichsten In-vitro- Tests in Studium Schwann-Zell-Interaktionen asrtocyte verwendet.
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Methodenartikel
Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Schwann-Zellen sind eine der häufigsten verwendete in Reparatur befindlichen Zellen Strategien nach Rückenmarksverletzungen. Schwann-Zellen sind in der Lage zu unterstützen axonale Regeneration und Sprossung durch Sekretion Wachstumsfaktoren 1,2 und Bereitstellung von wachstumsfördernden Adhäsionsmoleküle 3 und extrazelluläre Matrix Moleküle 4. Außerdem sind sie myelinisieren der demyelinisierte Axone an der Stelle der Verletzung 5.
Doch nach der Transplantation, tun Schwann-Zellen nicht von der Stelle des Implantats zu migrieren und nicht mit dem Host-Astrozyten 6,7 vermischen. Dies führt zur Bildung einer scharfen Grenze zwischen Schwann-Zellen und Astrozyten, wodurch ein Hindernis für den Anbau von Axonen versucht, das Transplantat wieder in das Wirtsgewebe proximal und distal zu verlassen. Astrozyten in Kontakt mit Schwann-Zellen auch zu unterziehen Hypertrophie und Up-Regulierung der hemmenden Moleküle 8-13.
In vitro-Untersuchungen haben zu modellieren Schwann-Zell-Interaktionen Astrozyten verwendet worden und wurden in das Verständnis des Mechanismus der zellulären Verhaltens wichtig.
Diese in-vitro-Assays gehören Grenze Assay, wo eine Co-Kultur unter Verwendung von zwei verschiedenen Zellen, die mit jedem Zelltyp zu besetzen verschiedene Gebiete mit nur ein kleiner Spalt zwischen den beiden Fronten Zelle ist. Da die Zellen teilen sich und wandern, bekommen die beiden zellulären Fronten einander näher und schließlich kollidieren. Dies ermöglicht dem Verhalten der beiden Zellpopulationen an der Grenze analysiert werden. Eine weitere Variante der gleichen Technik ist es, die beiden Zellpopulationen in der Kultur-Mix und im Laufe der Zeit die beiden Zelltypen mit Schwann-Zellen zu trennen verklumpten als Inseln zwischen Astrozyten zusammen Erstellen mehrerer Schwann-Astrozyten Grenzen.
Der zweite Test in der Untersuchung der Interaktion von zwei Zelltypen ist die Migration-Assay, wo zelluläre Bewegung auf der Oberfläche der anderen Zelltyp Monoschicht 14,15 verfolgt werden können. Dieser Test wird im Allgemeinen als umgekehrt Deckglas Test bekannt. Schwann-Zellen werden auf kleine Glassplitter kultiviert und sie sind Gesicht invertiert hinunter auf die Oberfläche der Astrozyten Monoschichten und Migration ist von der Kante des Deckglases beurteilt.
Beide Tests wurden bei der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der zellulären Ausgrenzung und Grenzen Bildung beteiligt instrumental. Einige der identifizierten Moleküle mit diesen Techniken gehören N-Cadherine 15, Chondroitinsulfat Proteoglykane (CSPGs) 16,17, FGF / Heparin 18, Eph / Ephrine 19.
Dieser Artikel will Grenze Assay und Migration-Assay in schrittweise beschreiben und erläutern die möglichen technischen Probleme, die auftreten könnten.
Protokoll
1. Boundary-Test:
- Grundlegende Zubereitung: Chamber Slides sind mit Poly-D-Lysin über Nacht und sterile Objektträger beschichtet sind, bevor das Experiment vorbereitet. Medium wird hergestellt unter Verwendung Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Fungizon (PSF). Auch eine Flasche Calcium / Magnesium freie Hanks balanced salt solution (HBSS) hergestellt.
- Primäre Ratten-Schwann-Zellen in Kolben kultiviert werden für 3 Minuten mit 0,1% Trypsin Trypsin behandelt. Primäre Ratten-Astrozyten Kultur ist für 5 Minuten mit 0,1% Trypsin Trypsin behandelt.
Trypsin wird durch Zugabe von DMEM, ergänzt mit 10% FCS und 1% PSF inactived. - Trypsiniert Schwann-Zellen und Astrozyten übertragen werden zu 15 mL Falcon-Röhrchen zu trennen und zentrifugiert bei 300G für 5 Minuten.
- Schwann-Zellen und Astrozyten sind an der Dichte von 2 x 10 6 resuspendiert (siehe Abschnitt repräsentative Ergebnisse für die Unterschiede in der Zelldichte).
- 50 uL Tropfen Schwann Zellsuspension wird an einem Ende der PDL beschichtete Kammer schieben Vertiefungen gegeben. Ein Glas Streifen wurde verwendet, um Abstrich der Tropfen in Richtung der Mitte der Kammer auf eine gerade Kante zu erzeugen. (Mit einem Glasschneider, sind ein rechteckiges Deckgläser längs so, dass es die Breite der Kammer-Objektträgern für Boundary-Assays verwendet fit cut)
- Ein zweiter Tropfen 50 ul Astrozyten Suspension wurde am gegenüberliegenden Ende des gleichen gut aufgestellt und verschmiert in Richtung Zentrum, um eine gerade Kante parallel zur ersten Drop-Abstrich mit einem kleinen 0,2 mm Abstand zwischen ihnen zu schaffen.
- Die Kammer Folien mit den Tropfen in den Inkubator bei 37 º C für 2 Stunden.
- Nach 2 Stunden wurden die Kulturen mit DMEM gewaschen, um nicht angebracht Zelltrümmer und frisches Medium mit DMEM / 10% FCS / 1% PSF aufgenommen zu entfernen.
Hinweis: DMEM / 10% FCS / 1% PSF mit Forskolin (2 um) und Bovine Hypophysenextrakt (BPE) (10 ug / mL) stimuliert Schwann-Zellen ergänzt werden kann. BPE liefert die Wachstumsfaktoren notwendig, um langfristig Schwann Zellkultur ermöglichen und Forskolin erhöht die zyklische Adenosinmonophosphat Ebenen innerhalb der Schwann-Zellen zur Proliferation induzieren - Die Zellen werden für ca. 8-10 Tage bei 37 ° C, 7% CO 2-Inkubator. Das Medium benötigt, um alle 3 Tage gewechselt werden. Die beiden Zellen Fronten stößt irgendwann einander und eine scharfe Grenze zwischen den beiden Zelltypen zu bilden. Zu diesem Zeitpunkt Experimente durchgeführt werden können analysiert Faktoren in Grenzen Bildung beteiligt.
- Co-Kultur kann fest mit 4% Formaldehyd und Schwann-Zellen mit anti-P75-Antikörper und Astrozyten mit anti-GFAP Antikörper gegen die Zellen in Co-Kultur identifizieren immungefärbt werden. P75 Antikörper erkennt eine geringe Affinität NGF-Rezeptor auf Schwann-Zellen, die Astrozyten fehlt. Anti-GFAP Antikörper erkennt Gliazellen firbrillary sauren Protein, das an Astrozyten Zytoplasma lokalisiert. (Siehe Abbildung 1A für repräsentative Grenze)
2. Migration Assay:
- 4 gut Platten (15mm Bohrlöcher) sind PDL beschichtet Nacht und bereit für die Erstellung von Astrozyten Monoschichten.
- Primäre Astrozyten Kultur ist für 5 Minuten mit 0,1% Trypsin Trypsin behandelt. Trypsin wird durch Zugabe von DMEM mit 10% FCS und 1% PSF und Zell am 300G für 5 Minuten zentrifugiert ergänzt inaktiviert. (Siehe Abbildung 2)
- Astrozyten sind bei 1x10 5 Zellen / ml resuspendiert. 1 mL dieser Lösung ist es, jedem PDL beschichtet und in 4-Well-Platten aufgenommen. Astrozyten sind für 24-48 Stunden kultiviert, bis die Monoschicht vollständig konfluent.
- Um Schwann-Zell-Migration auf Astrozyten Monoschichten zu beurteilen, parallel zur Schaffung Astrozyten Monoschichten, kreisförmigen PDL-beschichteten Deckgläschen in einer 50 ml-Röhrchen gegeben und zerkleinert mit einem Kunststoff-Pipette, um kleine Bruchstücke zu schaffen.
- Glas-Fragmente werden in einen Brunnen in 6-Well-Platte überführt und mit einer Pinzette eignet große Fragmente ausgewählt und platziert in anderen Brunnen. 5 Glas-Fragmente werden in jedes Well in 6-Well-Platten gelegt.
- Primäre Schwann-Zellen in Kolben kultiviert werden für 3 Minuten mit 0,1% Trypsin Trypsin behandelt. Trypsiniert Schwann-Zellen übertragen werden zu 15 ml Falcon-Röhrchen zu trennen und zentrifugiert bei 300 G für 5 Minuten. Schwann-Zellen sind mit 2x 10 6 Zellen / ml in DMEM/10% FCS / 1% PSF resuspendiert.
- 20 uL Tropfen von Schwann-Zellen Suspension wird über je 5 Deckglas Fragmente in 6-Well-Platten und Zellen gelegt werden bei 37 ° C, 7% CO 2 für 2 Stunden inkubiert.
- Nach 2 Stunden werden die Schwann-Zellen, die Bruchstücke Deckglas befestigt und DMEM/10% FCS / 1% PSF (ergänzt mit 2 um von Forskolin und 10 ug / mL der BPE ist zu jeder Vertiefung gegeben, so dass die Fragmente vollständig mit Medium bedeckt) .
- Die 6-Well-Platten, die die Fragmente werden dann in den Inkubator für 24-48 Stunden gestellt, bis die Glassplitter vollständig confließend mit Schwann-Zellen.
- Sobald Fragmente konfluent mit Schwann-Zellen sind, ist jedes Fragment vorsichtig mit scharfen Zange nahm und tauchte in HBSS auf ungebundene Zellen zu entfernen und dann umgedreht dem Gesicht nach unten auf Astrozyten Monoschicht.
- Jedes der gut wird dann mit 1 ml DMEM/10% FCS / 1% PSF und Schwann-Zellen erlaubt, für 24 bis 48 Zeitraum migrieren abgedeckt sind. Während dieser Zeit experimentelle Reagenzien wie Wachstumsfaktoren zugesetzt werden, um deren Auswirkung auf die Anzahl und Abstand der Migration von Schwann-Zellen zu beurteilen.
- Nach der Zeit der Völkerwanderung, sind die Glassplitter auf dem Boden jeder Vertiefung durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 Minuten fixiert. Nach Fixierung immunostain den Schwann-Zellen für p75 (Erkennen geringe Affinität NGF-Rezeptor), dann färben sie mit ABC Streptavidin Kit-Diaminobenzidin (DAB), um die Visualisierung der Schwann-Zellen unter dem Lichtmikroskop zu ermöglichen.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Nach 8-10 Tagen Schwann-Astrozyten Co-Kulturen zeigen eine scharfe Grenze zwischen den beiden Zelltypen. Diese Grenze ist stärker ausgeprägt, wenn Forskolin und BPE in der Kultur genutzt wird, wie Schwann-Zellen wird verbessert.
Wenn keine Grenze während des Zeitraums von 10 Tagen beobachtet wird, kann die Zeit der Kultur weiter erhöht werden, bis die Grenzen festgelegt sind. Ändern des Verhältnisses der Zelldichte ist eine alternative Möglichkeit, die Grenze Bildung zu erhöhen. Ein Verhältnis von 3:1 Schwann: Astrozyten Zelldichte kann bei der Vorbereitung von Zellsuspensionen 8,18 sein.
Nach Immunfärbung der Schwann-Zellen und Astrozyten zu identifizieren, zu Zelle Vermischung eine Linie gezogen werden, wo die Grenze ist festgelegt und die Zahl der Schwann-Zellen wandern in die Astrozyten Gebiet kann unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt werden zu beurteilen.
Unten sind zwei Beispiele von Bildern erhalten Grenzen, eine mit gut ausgebildeten Trennung von Schwann-Zellen und Astrozyten (Abbildung 1A) und eine, wo die Zellen nicht getrennt haben und in verschiedene Gebiete aufgrund schlechter Technik (Abbildung 1B).
. Abbildung 1 Boundary-Test: Schwann-Astrozyten-Interaktion. A) Eine 10 Tage Co-Kultur-Assay in Gegenwart von Forskolin und BPE zu Schwann-Zellen zu stimulieren zeigt eine scharfe Grenze zwischen den beiden Zelltypen (rot = P75, grün = GFAP). B) A 10 Tage Co-Kultur-Test, wo die Grenze nicht gebildet ist und die beiden Zellen Fronten gemischt. Dies war aufgrund der beiden Tröpfchen Mischen beim Platzieren Astrozyten und Schwann-Zellen Tröpfchen nebeneinander bei der Vorbereitung der Grenze (rot = P75, grün = GFAP).
Abbildung 2. Representative Bild von konfluenten Astrozyten Monoschicht
Migration-Assays beurteilen Bewegung eines Zelltyp über die Oberfläche eines anderen Zelltyp und somit prüfen, um ein anderes Phänomen aus, daß der Grenze Bildung.
Praxis ist notwendig, um Umdrehen der Deckgläser auf Monoschichten sicher nicht zu einer Beschädigung der Schwann-Zell-bedeckten Glassplittern und Astrozyten Monoschichten durch die scharfen Zangen. Beschädigung Zur Beurteilung der Migration von Schwann-Zellen, die maximale Entfernung der Migration und die Anzahl der wandernden Zellen vom Rand des Deckglases kann unter dem Lichtmikroskop gemessen werden.
Unten ist das Bild von Schwann-Zellen mit P75 Antikörper mit DAB-Färbung auf der Oberfläche der Astrozyten Monoschicht (Abbildung 3) gefärbt.
Abbildung 3. Migration Assay mit invertierten Deckglas Assay. A) Schwann-Zellen (braun, immungefärbt mit p75-Antikörper) Migration weg von der Kante des Deckglases. Der Pfeil zeigt auf die Richtung der Zellmigration vom Deckglas.
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Diskussion
Die oben beschriebenen Assays wurden in verschiedenen Studien, die die Rolle der verschiedenen Faktoren in Grenzen Bildung zwischen den Schwann-Astrozyten und begrenzt Schwann Zell-Migration in Astrozyten Umfeld eingebunden worden.
Das Verständnis der Mechanismen, die diese Ereignisse ist wichtig, da es erlauben würde, die Entwicklung von Strategien zur Optimierung und Verbesserung der Integration von Schwann-Zellen Transplantate nach der Transplantation und damit erleichtern Sie die Ausfahr...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir möchten Philippa Warren für ihre freundliche Hilfe danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Deckgläser | VWR international | 631-0149 | |
| Deckgläser (rechteckig) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Kammerobjektträger | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4-Loch-Platten, 6-Loch-Platten | Nalge Nunc international | 4-Loch-Platten6-Loch-Platten | |
| Antikörper gegen ratte p75 | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP-Antikörper | Dako | Z0334 | |
| Sekundäre Antikörper (mit Alexa markiert) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Ziegen-Anti-Maus 568Ziegen-Anti-Kaninchen 488 |
| Sekundäre biotinylierte Antikörper | Vector Laboratories | Ziegen-Anti-Maus | |
| DAB-Tabletten | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC Elite Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Feine Pinzette | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
Referenzen
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