Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Summary

Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.

Abstract

Ungenaue Replikation in Anwesenheit von DNA-Schäden verantwortlich ist für die Mehrheit der zellulären Umlagerungen und Mutagenese in alle Zelltypen zu beobachten und wird allgemein angenommen, um direkt mit der Entstehung von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht werden. DNA-Schäden, wie sie durch UV-Bestrahlung induziert wird, stark beeinträchtigt die Fähigkeit der Replikation der genomischen Vorlage exakt zu duplizieren. Eine Reihe von Genprodukten identifiziert worden, die erforderlich sind, wenn die Replikation Begegnungen DNA-Läsionen in der Vorlage. Allerdings hat eine verbleibende Herausforderung, wie diese Proteine ​​Prozess Läsionen während der Replikation bestimmen

Protocol

1. Wachstum und UV-Bestrahlung.

1. 200 ul einer frischen Übernacht-Kultur, die das Plasmid pBR322 in Davis Medium ¹ gewachsen mit 0,4% Glucose, 0,2% Casaminosäuren und 10 pg / ml Thymin (DGCthy mittel) und 100 ug / ml Ampicillin wird pelletiert. Das Zellpellet wird dann in 200 ul DGCthy Medium ohne Ampicillin resuspendiert und verwendet werden, um 20 ml DGCthy Beimpfen.
2. Kulturen sind ohne Ampicillin-Selektion in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C auf eine OD ₆₀₀ von 0,5 (~ 5 x 10 ⁸ Zellen / ml) gewachsen. Wachstum ohne Ampicillin verhindert Selektion gegen anormales oder unproduktive Replikation Zwischenprodukte, die....

Discussion

Typische Ergebnisse aus Wildtyp-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von UV-induzierten Schäden sind in Abbildung 1 dargestellt. In Abwesenheit von Schäden, kann ~ 1% der gesamten Plasmid-DNA in der Y-Bogen gefunden werden, wenn die Zellen rasch wachsende in der exponentiellen Phase. Nach der Bestrahlung ist ein vorübergehender Anstieg der Y-förmige Moleküle beobachtet, wie blockiert Replikationsgabeln an geschädigten Stellen ansammeln. Die X-förmige Replikation Zwischenprodukte auch vorübergehend ansammeln und bis zu .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ein Beispiel für die Südstaaten-Analyse des 2D-Gels sondiert	GE Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μ Watt keimtötende	Lampe Sylvania	F20T12/GO	UV-Lampe
Blak-Ray UV-Intensitätsmessgerät 254nm	Daigger	EF28195T	UVC-Photometer
0,025 μ m Porenscheiben	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Schwimmende Dialysescheiben
PvuII	Fermentas	ER0632	Restriktionsendonuklease
Nick-Translationskit	Roche Group	976776	Zur Herstellung von 32P-markierter
Sonde Löschpapier	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Für den Südtransfer
Nylonmembran	GE Healthcare	RPN203S	Für den Transfer in den Süden