Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.
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Methodenartikel
Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ungenaue Replikation in Anwesenheit von DNA-Schäden verantwortlich ist für die Mehrheit der zellulären Umlagerungen und Mutagenese in alle Zelltypen zu beobachten und wird allgemein angenommen, um direkt mit der Entstehung von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht werden. DNA-Schäden, wie sie durch UV-Bestrahlung induziert wird, stark beeinträchtigt die Fähigkeit der Replikation der genomischen Vorlage exakt zu duplizieren. Eine Reihe von Genprodukten identifiziert worden, die erforderlich sind, wenn die Replikation Begegnungen DNA-Läsionen in der Vorlage. Allerdings hat eine verbleibende Herausforderung, wie diese Proteine Prozess Läsionen während der Replikation bestimmen
Protokoll
1. Wachstum und UV-Bestrahlung.
- 200 ul einer frischen Übernacht-Kultur, die das Plasmid pBR322 in Davis Medium 1 gewachsen mit 0,4% Glucose, 0,2% Casaminosäuren und 10 pg / ml Thymin (DGCthy mittel) und 100 ug / ml Ampicillin wird pelletiert. Das Zellpellet wird dann in 200 ul DGCthy Medium ohne Ampicillin resuspendiert und verwendet werden, um 20 ml DGCthy Beimpfen.
- Kulturen sind ohne Ampicillin-Selektion in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C auf eine OD 600 von 0,5 (~ 5 x 10 8 Zellen / ml) gewachsen. Wachstum ohne Ampicillin verhindert Selektion gegen anormales oder unproduktive Replikation Zwischenprodukte, die....
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Diskussion
Typische Ergebnisse aus Wildtyp-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von UV-induzierten Schäden sind in Abbildung 1 dargestellt. In Abwesenheit von Schäden, kann ~ 1% der gesamten Plasmid-DNA in der Y-Bogen gefunden werden, wenn die Zellen rasch wachsende in der exponentiellen Phase. Nach der Bestrahlung ist ein vorübergehender Anstieg der Y-förmige Moleküle beobachtet, wie blockiert Replikationsgabeln an geschädigten Stellen ansammeln. Die X-förmige Replikation Zwischenprodukte auch vorübergehend ansammeln und bis zu .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Arbeit in unserem Labor wird von CAREER-Preis MCB0551798 von der National Science Foundation und AREA gewähren R15GM86839 aus dem NIGMS-NIH unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ein Beispiel der Southern-Analyse des 2D-Gels, das untersucht wurde | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μWatt keimabtötende Lampe | Sylvania | F20T12/GO | UV-Lampe |
| Blak-Ray UV-Intensitätsmessgerät 254 nm | Daigger | EF28195T | UVC-Photometer |
| Scheiben mit 0,025 μm Porengröße | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Schwimmende Dialysescheiben |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriktionsendonuklease |
| Nick-Translation-Kit | Roche Group | 976776 | Zur Herstellung einer mit 32P markierten Sonde |
| Abdruckpapier | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | Für den Southern-Transfer |
| Nylonmembran | GE Healthcare | RPN203S | Für den Southern-Transfer |
Referenzen
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regres....
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Nachdrucke und Genehmigungen
