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Induktion und Überwachung von chronisch-rezidivierenden EAE
Die Emulsion ist eine 1:1-Mischung von Antigen in wässriger Lösung hinzugefügt ergänzt komplettem Freund-Adjuvans. Es ist sehr wichtig, um das Antigen an das Adjuvans und nicht umgekehrt hinzuzufügen!
Es gibt eine Menge von Abfällen, wenn Herstellung und Injektion einer Emulsion. Immer vorzubereiten 1,5 oder 2-mal mehr als das, was Sie brauchen.
Verwenden Sie autoklaviert Mörtel, Pistill, Glasspritzen und Brücken. Alle Kunststoffe sollten steril sein. Das Präparat kann in regelmäßigen Labortisch durchgeführt werden.
1. Vorbereitung des ergänzt adjuvante
Wiegen Sie 30 mg Mycobacterium tuberculosis (Difco Katalog # 231141) und in einen Mörser. Machen Sie in dünne Pulver ohne Druck zu hart, um zu vermeiden brechen die Bakterien. 10 ml komplettem Freund-Adjuvans H37Ra (Difco Katalog # 231131) und mischen. Dies ergänzt adjuvante enthält nun 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transfer in ein Rohr.
2. Vorbereitung der Rückenmark-Homogenat
Sammeln Rückenmark von DA-Ratten (Alter / Geschlecht gleichgültig) und bei -80 ° C eingefroren Wiegen Sie die gefrorenen Rückenmark haben genug, um 1:1 (Gewicht: Volumen) mischen sich mit den ergänzten Adjuvans. Mince das Rückenmark so fein wie möglich mit einer Rasierklinge, um den Mörtel in Abschnitt 1 zu übertragen, und eine Paste mit dem Pistill.
3. Herstellung der Emulsion
- Legen Sie ergänzt komplettem Freund-Adjuvans in einem Rohr. Vortex mit hoher Geschwindigkeit. Fügen Sie die Rückenmark-Homogenat tropfenweise unter Vortexen. Wenn alle Rückenmark-Homogenat hinzugefügt wird, Wirbel für weitere 5 Minuten. Die Mischung sollte wiederum hellrosa.
- Legen Sie die Emulsion in einem 5 ml Glasspritze und verknüpfen es mit weiteren 5 ml Glasspritze mit einer 18G-Brücke (Fisher Katalog # 14-825-17L). Senden Sie die Emulsion aus einer Spritze auf der anderen, bis sie hart (5-10 min) wird. Wenn mehr als 5 ml Emulsion hergestellt wird, nutzen mehrere 5 ml Spritzen KEINE größere Spritzen.
- Die Emulsion kann in die Spritzen bei 4 ° C für 3 Wochen gelagert. Ich empfehle bereitet es mindestens 12 Stunden im Voraus zu überprüfen, ob sie nicht brechen. Es sollte auch weiterhin dick und nicht getrennt in 2 Phasen. Die Farbe wird über Nacht ändern, um eine hellgelbe oder beige.
4. Die Immunisierung der Ratten
- Mix der Emulsion in die Spritzen für ein paar Minuten und Transfer zum Spritzen für die Injektion verwendet. Inject 200 ul subkutan in die eigentliche Basis des Schwanzes mit 23G Nadeln und 3 ml Luer-Lock Spritzen unter kurzfristigen Anästhesie.
- Die Empfänger sind 7-9 Wochen alte weibliche DA-Ratten. Wir bekommen unsere Ratten von Harlan-Sprague Dawley.
- Ratten sollte zweimal täglich beobachtet und gewogen täglich. Klinische Symptome sind 7-15 Tage nach der Injektion der Emulsion zu erwarten.
Klinische Wertung:
0: keine Krankheit
0,5: distalen schlaffen Schwanz
1: schlaffe Schwanz
2: mild Paraparese, Ataxie
3: mäßige Paraparese, die Ratten Reisen von Zeit zu Zeit
3,5: ein Hinterbein des Körpers ist gelähmt, die andere bewegt sich
4: komplette Hinterbein Lähmung
5: komplette Hinterbein Lähmung und Inkontinenz
6: moribund, Atembeschwerden, nicht essen oder trinken. Euthanize sofort.