Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in Ausdruck Xenopus Oozyten Durch die Injektion von Boten-RNA. Die intrazelluläre Lösung während Patch Clamp Messungen wird durch eine Perfusion System gesteuert.
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Methodenartikel
Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Protokoll hier vorgestellten soll die Aktivierung der großen Leitfähigkeit, Spannungs-und Ca 2 +-aktivierten K + (BK) Kanäle zu studieren. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um die Struktur-Funktions-Beziehung für andere Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren-1-Studie sein. BK-Kanäle sind weit verbreitet in verschiedenen Geweben exprimiert und haben in vielen physiologischen Funktionen, einschließlich der Regulierung der Kontraktion der glatten Muskulatur, Frequenzabstimmung von inneren Haarzellen und Regulierung der Freisetzung von Neurotransmittern 2-6 in Verbindung gebracht. BK-Kanäle werden durch Membran-Depolarisation und durch intrazelluläre Ca 2 + und Mg 2 + 6-9 aktiviert. Daher ist das Protokoll, mit dem sowohl die Membran-Spannung und die intrazelluläre Lösung zu kontrollieren. In diesem Protokoll wird Boten-RNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) von 2-5 Tagen Inkubation bei 18 ° C 10-13 gefolgt injiziert. Membrane Patches, die einzelne oder mehrere BK-Kanäle enthalten, werden mit der inside-out-Konfiguration mit Patch-Clamp-Techniken 10-13 herausgeschnitten. Die intrazellulären Seite der Patch mit der gewünschten Lösungen während der Aufnahme, so dass die Kanal-Aktivierung unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden kann perfundiert. Zusammenfassend ist die mRNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten injiziert, um Kanal-Proteine an der Eizelle Membran auszudrücken; Patch-Clamp-Techniken werden benutzt, um Ströme durch die Kanäle unter kontrollierten Spannung und intrazelluläre Lösungen aufnehmen.
Protokoll
1. Die Injektion von mRNA in Oozyten
- Inject von 0,05 bis 50 ng Boten-RNA, die in vitro in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) mit Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (Drummond Scientific Company, Modell 3-000-204) transkribiert wurde. Wiederholen Sie die Injektion auf ein Dutzend Eizellen für jede mRNA.
- Spülen Sie den injizierten Oozyten zweimal mit ND-96-Lösung (96 mM Natriumchlorid (NaCl, Herr 58,44 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, Herr 74,56 g / mol), 1,8 mM Calciumchlorid (CaCl 2 • 2H 2 O Herr 147,02), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6H 2 O, Herr 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hy....
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Diskussion
Die Eizelle Ausdruck System ist ideal für elektrophysiologische Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen aufgrund der relativ niedrigen Hintergrund der endogenen Kanäle. Darüber hinaus, da es sich um eine vorübergehende Expression System ist, bietet es eine effiziente Methode zur Durchführung Mutagenesestudie dieser Kanäle. Es ist jedoch zu beachten, dass die Eizelle Expressionssystem anders als in Säugerzellen ist, so kann es Unterschiede in post-translationale Modifikation und Verknüpfung mit verschieden.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt R01-HL70393 und R01-NS060706 zu JCJC unterstützt ist Professor für Biomedizinische Technik an der Spencer T. Olin Endowment.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter-Injektor | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 Flaming/Brown-Mikropipettenzieher | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Perfusionsystem und elektronische Steuerung | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Innendurchmesser der Perfusionspitze: 100 Mikrometer |
| Invertiertes Mikroskop | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Glaspipetten | VWR international | 53432-921 | |
| Flaming/Brown-Mikropipettenzieher | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Verstärker | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Computer-Schnittstelle | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
Referenzen
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y.
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Nachdrucke und Genehmigungen
