Wir beschreiben eine einfache, schnelle und robuste Methode für die Bildung von Candida albicans Biofilmen mit 96 well Mikrotiterplatten und seinen Nutzen in antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Zellen in Biofilmen.
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Methodenartikel
Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Candida albicans bleibt die häufigste Ursache von Pilzinfektionen in einem expandierenden Bevölkerung gefährdet Patienten und Candidiasis ist jetzt das dritte häufigste Infektion in US-Krankenhäusern. Unterschiedliche Erscheinungsformen von Candidiasis sind mit Biofilmbildung, sowohl auf dem Host-Gewebe und / oder medizinische Geräte (zB Katheter) verbunden. Biofilmbildung führt negativen klinischen Folgen, wie Zellen innerhalb des Biofilms von der Host-Immunantwort und durch die Einwirkung von Antimykotika sind geschützt. Wir haben eine einfache, schnelle und robuste In-vitro-Modell für die Bildung von C entwickelt albicans Biofilmen mit 96 well Mikrotiterplatten, die auch für Biofilm antimykotische Antibiogramm eingesetzt werden können. Die Anzeige dieses Tests kolorimetrisch, basierend auf der Reduktion von XTT (a Tetrazoliumsalz) durch metabolisch aktive Pilz Biofilm-Zellen. Ein typisches Experiment dauert ca. 24 h für die Bildung von Biofilmen, mit einer zusätzlichen 24 h für antimykotische Empfindlichkeitsprüfung. Aufgrund seiner Einfachheit und die Verwendung von allgemein verfügbaren Labor-Materialien und Geräte, demokratisiert diese Technik Biofilm-Forschung und stellt einen wichtigen Schritt in Richtung Standardisierung der antimykotischen Empfindlichkeitstestung von Pilzen Biofilmen.
Protokoll
1. Vorbereitung von C. albicans
C. albicans ist ein Risk Group 1/BSL1 Mikroorganismus. Denken Sie daran, gute aseptische / sterile Techniken für die Arbeit die Verwendung mit diesem Mikroorganismus und folgen institutionellen Verfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung von biologischem Risikomaterial.
- Bereiten Sie eine Übernachtkultur von C. albicans in YPD (Yeast Peptone Dextrose) flüssigen Medium durch Animpfen einer Einzelkolonie von C. albicans in 25 ml YPD.
- Inkubieren Kultur in einem Schüttler (ca. 180 rpm) bei 30 ° C über Nacht. Die meisten C. albicans Stämme werden a....
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine einfache, schnelle, kostengünstige und hoch reproduzierbare 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Candida Biofilmen mit einer kolorimetrischen Methode, die die Stoffwechselaktivität der Zellen Maßnahmen innerhalb des Biofilms mit XTT gekoppelt. Diese 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Biofilmen wurde ursprünglich für C entwickelt albicans, aber auch für andere Candida spp verwendet werden. und einfach für andere pilzliche Organi.......
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Offenlegungen
JLL-R besitzt Aktien in MicrobeHTS Technologies, Inc., die Entwicklung von Antimykotika ist. MicrobeHTS Technologies, Inc. keine finanzielle Unterstützung für diese Studien.
Danksagungen
Biofilm-bezogenen Arbeit im Labor wird durch Zuschüsse finanziert nummeriert R21DE017294 und R21AI080930 vom National Institute of Dental & Craniofacial Forschung und dem Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (zum JLL-R.). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der NIDCR, die NIAID oder die NIH.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Sabouraud-Dextrose-Agar | BD Biosciences | 211584 | Zur Herstellung von Platten für frische Subkulturen von Pilzisolaten |
| YPD: Hefe-Pepton-Dextrose | US Biological | Y2076 | Medium zur Vermehrung von Übernachtkulturen in Flüssigkeit |
| RPMI-1640 ohne Natriumbicarbonat, ergänzt mit L-Glutamin | Cellgro | 50-020-PB | Flüssigmedium für die Biofilmbildung |
| Morpholinpropanesulfonsäure (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | Zur Pufferung von RPMI 1640 |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Puffer für Waschschritte |
| XTT-Natriumsalz | Sigma-Aldrich | X4251 | Siehe oben für Herstellungsanweisungen |
| Ringer’s Laktat | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | Zur Herstellung der XTT-Lösung |
| Menadion | Sigma-Aldrich | M5625 | Vorsicht: gefährlich bei Hautkontakt, Einatmen oder Verschlucken |
| Petri-Schalen | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kegelförmige Zentrifugenröhrchen, 15 ml | Corning | 430790 | |
| Kegelförmige Zentrifugenröhrchen, 50 ml | Corning | 430828 | |
| Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen: Polystyrol, flachbodig, zellkulturgeeignet | Corning | 3595 | |
| Mehrkanalpipette und Pipettenspitzen | Eppendorf | ||
| Brutschrank | Jeder Lieferant | ||
| Mikrotiterplattenreader | Jeder Lieferant |
Referenzen
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
