Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies

Summary

Pluripotenten Stammzellen in Suspension wachsende Differenzierung in Embryoidkörpern (EBS). Hier zeigen wir, wie eine hohe Qualität EB Kryoschnitten nützlich für die Untersuchung zellulärer und molekularer Aspekte der Embryogenese zu erhalten, unter Wahrung ihrer Organisation als Aggregate.

Abstract

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind pluripotente Zellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste-Phase Anfang Säugerembryonen ¹ abgeleitet. Eine entscheidende Etappe in der Differenzierung von ES-Zellen ist die Bildung von Embryoidkörpern (EVG) Aggregate ^{2, 3.} EB Bildung ist auf spontane Aggregation basiert, wenn ES-Zellen in nicht haftenden Platten kultiviert. Ektoderm, Mesoderm und Endoderm ^4: Dreidimensionale EB rekapituliert viele Aspekte der frühen Embryogenese von Säugetieren und in die drei Keimblätter differenzieren.

Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung sind allgemein Techniken für die Detektion von Target-Proteinen und mRNA in Zellen eines Gewebes § ^{5, 6, 7} verwendet. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Technik, um qualitativ hochwertige Gefrierschnitte von Embryoidkörpern generieren. Dieser Ansatz stützt sich auf die räumliche Orientierung der EB Einbettung in OCT gefolgt von den Gefrier-Technik. Die daraus resultierenden Abschnitte können auf eine Vielzahl von analytischen Verfahren unterzogen werden, um Populationen von Zellen, die bestimmte Proteine, RNA oder DNA zu charakterisieren. In diesem Sinne sind die Herstellung von EB Kryoschnitten (10 um) wesentliche Instrumente für die Histologie Färbung Analyse (zB Hämatoxilin und Eosin, DAPI), Immunfluoreszenz (zB Oct4, Nestin) oder in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann auch dazu beitragen, Aspekte der Embryogenese in Bezug auf die Aufrechterhaltung des dreidimensionalen sphärischen Struktur des EBs zu verstehen.

Protocol

1. Fixation und Kryokonservierung

Pluripotenten Stammzellen wurden auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) mit Mitomycin C inaktiviert und gepflegt in DMEM/F12 ergänzt mit 20% Knockout Serumersatz (KSR) und 8ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2) kultiviert. Um EB induzieren H9-Zellen wurden auf nicht-haftenden Schalen überführt und kultiviert für 7 Tage, in DMEM/F12 mit 15% KSR ⁸ ergänzt gepflegt.

Hinweis (!): Diese Technik kann für EBs aus allen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet werden.

1. Sammeln Sie die EBs aus der Kulturschale mit einer Pipette.
2. Transfer-E....

Discussion

Die hier beschriebene Methode bietet eine einfach zu folgen Protokoll PFA fixiert dünne Kryostatschnitte von Embryoidkörpern nützlich für Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung Assays zu erhalten. Die daraus resultierende Kryoschnitten erlauben die Untersuchung von zellulären und molekularen Aspekten der menschlichen embryonalen Stammzellen die Differenzierung unter Wahrung ihrer Struktur und Organisation als Aggregate.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D (+) Saccharose-Reagenz		Vetec	228
Paraformaldehyd-Reagenz		Rieden-de Haë n	16005
PBS-Lösung	Reagenz	LGC Biotecnology	13-30259.05
Poly-L-Lysinhydrobromid	Reagenz	Sigma-Aldrich	P2636	200 mg/ml in Wasser
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Reagenz	Sakura Finetek	P2636
Saccharose	Lösung Reagenz			10% Saccharose Lösung in PBS w/v
	Saccharoselösungsreagenz			20% Saccharoselösung in PBS w/v
Saccharoselösung	Reagenz			30% Saccharoselösung in PBS w/v
konisches Rohrwerkzeug		Techno Plastic Products	91015	15mL konisches Rohr
Plattenschüttler	Werkzeug	Biomixer
Kryostat	Werkzeug	Leica Microsystems	CM 1850
Form für OCT-Plattform	Werkzeug			Kunststoffform Plattform