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1. Probenvorbereitung
Der erste Schritt in Western-Blot ist die Probenvorbereitung. Zur Vorbereitung Proben für den Betrieb eines Gels Zellen und Gewebe müssen lysiert, um die Proteine von Interesse freizugeben.
- Eine bequeme, ready-to-use Reagenz, das vielseitig und leicht zu lösliches Protein-Extraktion verwendet wird, ist CytoBuster oder PhosphoSafe. Diese Extraktionspuffer enthalten Waschmittel für die effiziente Gewinnung von löslichen Proteinen aus Säugetier-und Insektenzellen optimiert. Die sanfte, nicht-ionische Zusammensetzung der CytoBuster Protein Extraction Reagent ermöglicht Isolation von funktionell aktiven endogenen oder exprimierten Proteine, ohne die Notwendigkeit für sekundäre Behandlung wie Ultraschall oder Frost / Tau. PhoshoSafe hat den zusätzlichen Vorteil, mit vier Phosphatase-Inhibitoren.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (zB 5 min bei 2500 xg), lassen Sie das Zellpellet gut.
- Resuspendieren der Zellen in CytoBuster Protein Extraction Reagent mit 150 ul pro 10 6 Zellen (optimale Menge an CytoBuster Protein Extraction Reagent kann auf Zellgröße variieren).
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- In einen geeigneten Schlauch und Spin für 5 min bei 16.000 xg bei 4 ° C.
- Übertragen gelöscht Überstand (Zellextrakt) in ein frisches Röhrchen und fahren mit der Analyse.
- Für spezielle Protein-Extraktion, empfehlen wir die Verwendung unserer hochwertigen ProteoExtract Kits. EMD verfügt über mehr als ein Dutzend Kits für mitochondriale Isolierung, subzelluläre Proteom-Extraktion, Transmembranprotein Extraktion, und viele andere. Bitte besuchen Sie unsere Western-Blot-Landing-Page für weitere Details.
- EMD verkauft auch eine Vielzahl von Protease-und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail-Sets. Sobald Lyse auftritt, beginnen Proteolyse, Dephosphorylierung und Denaturierung. Diese Ereignisse können sich enorm sein, wenn die Proben auf Eis oder bei 4 gehalten werden verlangsamt ° C zu allen Zeiten und geeignete Inhibitoren werden in frischem Zustand an den Lysepuffer. Bitte besuchen Sie unsere Western-Blot-Landing-Page für weitere Details.
2. SDS-PAGE
Der zweite Schritt in Western-Blot ist Protein-Trennung. Proteine sind auf der Grundlage Molekulargewicht aufgetrennt.
- Sie können Ihre eigene PAGE-Gel zu machen, aber wir werden mit einem handelsüblichen pre-cast-Gel.
- Nach der Vorbereitung Ihrer Probe, sind Sie bereit, die Protein-Konzentration bestimmen. EMD hat zwei Kits für diese die Konzentration zu messen, nämlich zum einen die nicht störende Protein Assay Kit und das andere ist das BCA Protein Assay Kit.
- Sobald die Proteinkonzentration beurteilten wir sind bereit, unsere Probe für das Laden der Gel vorzubereiten. Antikörper in der Regel erkennt ein kleiner Teil des Proteins von Interesse (im Folgenden als das Epitop) und dieser Domain können innerhalb der 3D-Konformation des Proteins befinden. Um den Zugriff des Antikörpers an diesem Teil ist es notwendig, das Protein zu entfalten.
- Um denaturieren, verwenden Sie einen Ladepuffer mit dem anionischen denaturierenden Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS), und kochen Sie die Mischung bei 95-100 ° C für 5 Minuten. Eine einfache und bequeme Ladepuffer zu bedienen ist 4X Sample Buffer.
- Legen Sie die erste Spur der gut mit Trail Mix Protein Marker. Dieser Marker hat drei Referenz-Bands, die man Elektrophorese überwachen können. Wenn das Gel gefärbt ist, sind 10 Banden sichtbar reicht von 10 bis 225 kDa.
- Füllen Sie die Elektrophorese-Einheit mit Laufpuffer. Für PAGE Gele, ist dies in der Regel 1X Tris-Glycin. Für detaillierte Puffer Rezepte finden Sie auf der Western-Blot-Seite. EMD bietet hochwertige Puffer Reagenzien mit unseren OmniPur chemische Linie. Führen Sie das Gel bei 220 V für 1 Stunde.
- Sobald der Proteine getrennt haben, färben Sie das Gel mit Coomassie-Blau, um sicherzustellen, die Proteine gleichmäßig und einheitlich migriert. RAPIDstain ist ein ultra-sensitive Fleck, ready-to-use ist. Keine Entfärbung erforderlich ist.
3. Protein übertragen
So wie Proteine mit einer elektrischen Ladung induziert werden können, um durch ein Gel in einem elektrischen Feld zu reisen, können so die Proteine in einem elektrischen Feld aus dem Gel werden auf eine Membran übertragen, die entweder PVDF oder Nitrocellulose.
- Heute werden wir eine nasse übertragen. In nassen übertragen, sind die Gel und Membran zwischen Schwamm und Papier (Schwamm / Papier / Gel / Membran / Papier / Schwamm) und alle sind fest zusammen, nachdem sichergestellt keine Luftblasen zwischen dem Gel und Membran gebildet eingeklemmt eingeklemmt. Das Sandwich wird in Transfer-Puffer, auf die ein elektrisches Feld angelegt wird überflutet. Die negativ geladenen Proteine Reise in Richtung der positiv geladenen Elektrode, sondern die Membran hält sie, bindet sie und verhindert, dass sie weiter auf.
- Zwei Arten von Membranen zur Verfügung: Nitrocellulose und PVDF. Beide funktionieren gut. Heute werden wir mit PVDF. PVDF-Membranen erfordern in Methano Einweichenl für ein paar Minuten, um eiskalt Transfer-Puffer für 5 Minuten. Das Gel muss auch für ein paar Minuten in eiskaltes Transferpuffer äquilibriert. Andernfalls kann das Gel während der Übertragung zu schrumpfen.
- Der Puffer für feuchte Übertragung 1X Tris-Glycin mit 20% Methanol. Detaillierte Puffer Vorbereitungen sind auf unserer Website verfügbar.
- Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, ist es eine gute Idee, um Proteine zu visualisieren, um auch sicher zu übertragen, ohne Lufteinschlüsse. Dies kann leicht mit RedAlert Western Blot Stain durchgeführt werden. Dieser Fleck ist ready-to-use und Entfärben kann einfach mit Wasser erfolgen.
4. Antikörper und Zubehör Reagenzien
- Der erste Schritt dabei Sondieren und Antikörper-Antigen ist, um die Membran zu blockieren. Das Blockieren der Membran verhindert unspezifische Hintergrund bindend.
- Entweder fettfreie Milch oder BSA kann als Blocking-Lösung verwendet werden. Wenn Sie jedoch phospho-spezifische Antikörper, ist es nicht empfehlenswert, Milch verwenden, da es hohen Hintergrund verursachen.
- EMD bietet mehrere hochwertige Blockierungsreagenzien, einschließlich Seablock, die eine Nicht-Säuger-Blocker und BLOT QuickBlocker, die bereit ist, ready-to-use Blocker. Wir haben auch hochwertige BSA (Fraktion V) zur Verfügung.
- Inkubieren Sie die Membran 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Dreimal in TBST oder PBST nach Inkubation. Eine einfache und bequeme Möglichkeit, TBST oder PBST machen, ist unsere Tabletten verwenden (PBS Tween Tablets / TBS Tween-Tabletten)
- Sobald die Membran blockiert wurde, sind Sie bereit, mit dem primären Antikörper inkubiert. EMD wurde mit einem umfassenden Portfolio an außergewöhnlichen Antikörper mit den besten Antikörper Garantie in der Industrie seit über 30 Jahren. Denken Sie daran, dass mit allen EMD Antikörper, wir eine 100% ohne Risiko-Garantie anbieten. Kauf eines Antikörpers und verwendet sie für keine Spezies-Spezifität oder Anwendung Sie wünschen. Wenn der Antikörper nicht zu Ihrer Zufriedenheit funktioniert, werden wir eine volle Gutschrift auf ein anderes Produkt verwendet werden. Für weitere Informationen, besuchen Sie bitte unsere Western-Blot-Web-Seite.
- Heute werden wir unseren Inkubation primärer Antikörper mit Lösung 1 von SignalBoost. SignalBoost ist ein großartiges Produkt ermöglicht das Signal erheblich verbessert werden. Einfach inkubieren Ihre primäre Antikörper in Lösung 1 und Inkubation für 1 Stunde oder wie gewohnt. Es gibt keine Notwendigkeit, weitere Blockierungsmittel hinzuzufügen. Alternativ können Sie BSA oder fettfreie Trockenmilch als Blockierungsmittel.
- Waschen mit TBST. Wir machen TBST mit dem ready-to-Auflösung TBST Tablette.
- Inkubieren Sie Ihre sekundären Antikörper mit Lösung 2 von SignalBoost. Inkubieren der sekundäre Antikörper in Blocking-Puffer für 1 Stunde. Waschen Sie die Membran wieder mehrmals mit TBST.
5. Erkennung
Für HRP konjugiert Sekundärantikörper wird ECL traditionell verwendet. Eine ausgezeichnete ECL-Reagenz wir anbieten, ist RapidStep. Die Vorteile der RapidStep sind, dass keine Vermischung der luminalen oder Enhancer benötigt wird. Einfach aufsprühen die Membran ein paar Mal und entwickeln mit x-ray-Film. RapidStep bietet niedrige Piktogramm Empfindlichkeit sowie die Licht für bis zu 2 Stunden nach der Zugabe von Substrat.