Summary
Dit protocol beschrijft de bereiding van een synthetisch tRNA substraat voor de
Abstract
Protozoaire parasieten behoren tot de meest verwoestende ziekteverwekkers van de mens verantwoordelijk is voor een verscheidenheid van ziekten, waaronder amebiasis, dat is een van de drie meest voorkomende oorzaken van overlijden als gevolg van parasitaire ziekten. De agent van amebiasis is de amoebe parasiet Entamoeba histolytica die er bestaat in twee fasen: de besmettelijke cyste gevonden in voedsel of water en de invasieve trophozoite leven in de darm. De klinische manifestaties van amebiasis variëren van asymptomatisch tot colitis, dysenterie of lever abcessen. E. histolytica is een van de zeldzame eencellige parasiet met 5-methylcytosine (5mC) in zijn genoom. 1, 2 Het bevat een enkel DNA-methyltransferase, Ehmeth, dat behoort tot de Dnmt2 familie. 2 Een rol voor Dnmt2 in de controle van repetitieve elementen heeft is opgericht in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 en Drosophila. zes Onze recente werk heeft aangetoond dat Ehmeth methyleert tRNA Asp, en deze bevinding geeft aan dat dit enzym een dubbele DNA / tRNA Asp methyltransferase-activiteit heeft. 7 Deze waarneming is in overeenstemming met de dubbele activiteit dat is gemeld voor D. discoideum en D. melanogaster. 8 De functionele betekenis van de DNA / tRNA specificiteit van Dnmt2 enzymen is nog onbekend. Om deze vraag was een methode om de tRNA methyltransferase activiteit van eiwitten te bepalen Dnmt2 vastgesteld. In deze video, beschrijven we een rechttoe rechtaan aanpak om een adequaat tRNA substraat voor te bereiden op Dnmt2 en een methode om de tRNA methyltransferase activiteit te meten.
Protocol
Voorwaarde voor het begin van het experiment:
- RNase-vrij water wordt gebruikt in de behandeling van RNA in het laboratorium om het risico van RNA wordt afgebroken door RNases te verminderen. Voor dit doel, het water wordt meestal behandeld met 0,1% v / v diethylpyrocarbonate (DEPC) gedurende minstens een uur bij 37 ° C en vervolgens geautoclaveerd (minstens 15 minuten) naar sporen van DEPC inactiveren.
- Pipetman pipetten worden gereinigd met een RNase decontaminatie-oplossing (RNase verdelger, biologische industrie Beit Haemek) voor gebruik.
- Eppendorf buizen en tips moeten worden gecertificeerd vrij van DNase en RNase om te proeven integriteit te bewaren.
1. tRNA Asp Voorbereiding
Deze procedure beschrijft een in vitro run-off transcriptie die kunnen worden gebruikt voor de synthese van tRNA. Deze procedure is een aanpassing van de ribozym methode eerder gepubliceerd. 9 Voor dit doel een template is ontworpen bestaande uit de T7 promotor en de complementaire sequenties van een self-splitsen van hammerhead ribozym en de vereiste tRNA. Transcriptie van deze sjabloon resulteert in een product splitsen zich op de 5 `-end op een manier die de volledige lengte tRNA wordt verkregen met een 5-OH` in plaats van een gefosforyleerd 5 `-end. De volledige lengte tRNA kan worden gezuiverd uit gesplitst hammerhead ribozym en ongekliefd producten door ureum-PAGE.
- PCR Primer en Template Design:
Met het oog op een efficiënte template te verkrijgen voor T7 RNA-polymerase gemedieerde in vitro transcriptie drie eisen moet worden voldaan.- De T7-promoter sequentie (5 `-TAATACGACTCACTATA-3 ') moet worden betrokken in de sjabloon.
- Ter verhoging van transcriptie efficiëntie moet de eerste drie nucleotiden van de getranscribeerde RNA worden guanosine.
- De juiste complementaire sequentie van het specifieke tRNA nodig is.
- PCR
Voor de versterking van template DNA, gebruikten we een standaard PCR-reactie in een eindvolume van 50 ul. Tabel 1 geeft een uiteindelijke concentraties (reactie voorbereid op het ijs) en programma voor de PCR. De lage annealing temperatuur gebruikt tijdens de eerste 10 cycli verantwoordelijk voor de slechts gedeeltelijke binding van de forward primer om de DNA-template. Ter vermindering van niet-specifieke binding van de annealing temperatuur werd verhoogd voor de verdere versterking 25 cycli.
Het succes van de template-amplificatie werd getest door een 1,3% agarosegel prestained met 1X GelRed oplossing (figuur 2). - Transcriptie
- T7 premix kan bereid worden 5x geconcentreerd (200 mM Tris-HCl, pH 8,1, 30 mM MgCl2, 1 mM Spermidine, 5 mM DTT, 2 ug / ml BSA en 0,01% Triton X-100) en werd gebruikt voor ten minste een week of vijf vries dooi cycli.
- De transcriptie mengsel moet worden voorbereid op kamertemperatuur.
- Transcriptie reacties werden bereid met behulp van 80 uL T7 premix, 80 pi PCR product, 80 pi NTP mix (25 mm) en aangepast tot 385 pi met MilliQ water. 15 pi (1,34 mg / ml) T7-RNA polymerase (eindconcentratie 0,05 ug / pi) worden toegevoegd om de reactie te starten.
- De reactie werd uitgevoerd gedurende 4 uur bij 37 ° C. De witte neerslag van pyrofosfaat geeft aan een succesvolle transcriptie.
- Zuivering
- Pyrofosfaat was gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 10.000 rpm.
- Supernatanten werden geleverd met een volume formamid laden kleurstof en gezuiverd op een 12% ureum-PAGE met behulp van20 W voor 2 uur. Demonteer de gel en plaats het op Saran Wrap.
- Vlekken op de gel met 3XGelRed oplossing aangevuld met 0,1 M NaCl gedurende 20 minuten. Bij UV-excitatie, het etiket van het tRNA band op de Saran Wrap met een permanente marker voor latere excisie. Als alternatief kan indien de verwachte opbrengst hoger is dan 50 ug bands gezien worden door UV-shadowing. Voor UV-shadowing, plaatst u de gel op een fluorescerende dunnelaagchromatografie plaat en verlichten met een UV-hand-lamp van bovenaf. Label bands, die verschijnen als niet-fluorescerende schaduwen in de gel (figuur 3), voor later excisie.
- tRNA bands werden uitgesneden met een scalpel en in 1,5 ml Eppendorf cups.
- Na toevoeging van 450 ul van 0,5 M NH 4 OAc worden de monsters bevroren bij -80 ° C gedurende 2 uur en daarna geïncubeerd bij 20 ° C, schudden met 550 rpm op een Eppendorf Thermoshaker 's nachts. 6. Het supernatant NH 4 OAc oplossingen van stap 5 worden gefilterd met Nanosep buizen (0,45 pm), spinning 90 seconden bij 8500 rpm te PAGINA vuil te verwijderen.
- Neerslag van geëlueerd tRNA's werd uitgevoerd door het toevoegen van 2,5 volumes van -80 ° C pure ethanol (pa), opslag bij -20 ° C gedurende de nacht en 2,5 uur centrifugeren bij 4 ° C en 15.500 toeren per minuut.
- Na het verwijderen van het supernatant pellets werden gedroogd in een SpeedVac en geresuspendeerd in MilliQ water.
- Concentraties werden bepaald met behulp van een Nanodrop-ND1000. De opbrengst van een 400 pi transcriptie was ongeveer 80-100 ug.
Problemen oplossen:
- Geen PCR-product. → Is de volgorde van de primers en template compatibel en zijn alle onderdelen in het reactiemengsel?
- Geen transcriptie product. → PCR zou het ongelijk zijn gesteld. Correct T7-promoter sequentie. Oplossingen te koud, terwijl de voorbereiding van de reactie. T7 Premix te oud.
- Product op de gel, maar geen geëlueerd product. → Ethanol voor neerslag niet koud genoeg, niet zuiver, niet de juiste volume.
2. Expressie en zuivering van het recombinante E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) Eiwit in E. coli BL21
Dit protocol is ook geschikt voor de bereiding van Dnmt2 eiwitten uit menselijke 10 en Drosophila. 11
- De E. histolytica Ehmeth gen werd geamplificeerd door PCR, gekloneerd in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) en geverifieerd met sequencing
- Het recombinante plasmide werd getransformeerd in E. coli (BL21) voor de expressie van recombinante eiwitten.
- Getransformeerde bacteriën werden geselecteerd op Luria-Bertani (LB) agar ampicilline (100 ug / ml) medium. Vier tot vijf kolonies werden opgepikt en geënt in 5 ml LB medium met geschikte selectieve marker (100 ug / ml ampicilline) en 's nachts geïncubeerd in een orbitale schudder bij 37 ° C.
- De cultuur gedurende de nacht gekweekt werd geënt in 500 ml 2X Yeast Extract Trypton (2XYT) medium met 100 ug / ml ampicilline, en geïncubeerd in een orbitale schudder bij 37 ° C tot de OD 600 van de cultuur bereikte 0,8.
- De expressie van de Dnmt2 recombinant eiwit werd geïnduceerd door het toevoegen van isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) bij een uiteindelijke concentratie van 0,5 mm tot de cultuur. De cultuur werd verder geïncubeerd in een orbitale schudder gedurende 16 uur bij 24 ° C. De tijd en temperatuur van incubatie zijn geoptimaliseerd om de vorming van insluitingslichamen te voorkomen.
- De cultuur werd gecentrifugeerd bij 4 ° C, 6000 rpm, in 200 ml Nalgene buizen voor 15 minuten. Het supernatant werd verwijderd en de pellet werd ingevroren bij -70 ° C gedurende ten minste 1 uur. Deze bevriezing stap verbetert de lysis van de bacteriën.
- De pellet werd geoogst in 30 ml lysis buffer (100 mM KCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 ug / ml lysozym en Leupeptine 100 ug / ml in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS)). Vanaf dit punt, was het cruciaal om de lysaat te houden op het ijs aan de inactivatie van het recombinante eiwit te voorkomen. Het lysaat werd gesoniceerd in een ijs-waterbad op het vaststellen van nee. 4 van een MSE (Londen, Verenigd Koninkrijk) sonifier (power hoog, amplitude 5, 30 seconden puls, 30 seconden rust gedurende 5 minuten). Bacteriële DNA die kunnen worden verbonden aan Ehmeth werd verwijderd met Benzonase Nuclease (Novagen) behandeling (5 U / ml gesoniceerd lysaat), gedurende 30 minuten op ijs. De lysis werd voltooid door toevoeging van 300 ul van BugBuster eiwitextractie reagens (Novagen) gedurende 30 minuten op bij 4 ° C onder zacht schudden op een rondschudapparaat (100 rpm).
- De recombinant GST-Ehmeth eiwit werd gezuiverd onder natieve omstandigheden op een glutathion-agarose hars volgens de instructies van de fabrikant (Sigma). Voor 25 ml lysaat werden 500 pi van drijfmest harskralen toegevoegd en geïncubeerd bij 24 ° C gedurende 1 uur.
- De kralen werden tweemaal gewassen met lysis buffer (10 volumes van lysis buffer per volume van de kralen) en 6 keer met koude PBS. Deze uitgebreide wasstappen verzekeren dat er geen was van Benzonase blijven voordat de elution stap.
- Recombinant Ehmeth eiwit werd geëlueerd van de glutathion-agarose parels door het incuberen van de kralen met 5 ml van glutathion elutie buffer (Tris HCl 50 mM pH 8,0, glutathion (Sigma) 10 mM) gedurende 12 uur bij 4 ° C met zachte rotatie. De kralen werden verwijderd door centrifugeren (2000 rpm, 5 minuten) en het supernatant werd verzameld.
- De elutie buffer in de supernatant werd vervangen door een opslag buffer (200 mM KCl, 10 mM EDTA, 0,1 mM DTT, glycerol 60% in PBS). Voor dit doel werd 5 ml van de bovenstaande geladen op de top een Millipore Microcon YM-30 centrifugale filter-apparaten (30 kDa afgesneden kolom) en gecentrifugeerd bij 8000 rpm gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Het concentraat werd verdund eiwit in opslag buffer (5 ml) en opnieuw op het filter apparaat. Dezelfde procedure moet worden herhaald op zijn minst drie keer om volledige vervanging van de elutie buffer te verzekeren door de opslag buffer. Tenslotte is de geconcentreerde eiwit moet worden verdund in ongeveer 300 uL van opslag buffer.
- De concentratie van het recombinante eiwit werd gemeten met een Bradford eiwit assay. Het recombinante enzympreparaat werd opgeslagen bij -20 ° C. Uiteindelijke concentratie van het enzym mag niet minder zijn dan 3 ng / ul als een geschikte concentratie voor de methylatie test.
- Het eiwit preparaat werd gecontroleerd door SDS-PAGE.
Let op: de voorbereiding van een actief enzym te verzekeren, moeten alle zuiveringsstappen worden gedaan op ijs en DTT moet vers worden bereid en toegevoegd aan de opslag buffer. Dit verzekert een actief enzym voor 6 maanden.
3. In vitro tRNA Methylatie Assay
Oplossingen en reagentia die moeten worden voorbereid:
- 1 M oplossing van tris (hydroxymethyl) aminomethaan. Breng de pH van de oplossing tot 8,0 met geconcentreerd zoutzuur (HCl).
- 5X Methylatie buffer (MB): 100 mM Tris pH 8,0, 100mm NH 4 OAc, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2. De MB kan worden voorbereid en opgeslagen bij -20 ° C zonder dithiothreitol (DTT).
- Bereid de ongelabelde S-adenosylmethionine (AdoMet) voorraad (eindconcentratie 1,5 mm) door het mengen van 5 pi AdoMet (New England Biolabs, 32 mM concentratie) met 101,67 ml gedestilleerd water.
- 5% trichloorazijnzuuroplossing (TCA)
- 100% ethanol
- Scintillatievloeistof 3 ml per monsterflesje.
De test:
- Een pipetteren regeling is voorbereid (tabel 2) voor een 40 ul eindvolume van methylatie test.
- In een 1,5 ml Eppendorf buis, was tRNA verdund met DEPC behandeld water tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM (1μg tRNA is gelijk aan 40 pmol)
- 4 pl van DTT werd toegevoegd (de concentratie van de stockoplossing) tot 8 ul van 5XMB oplossing.
- Het tRNA-oplossing werd geïncubeerd bij 85 ° C gedurende 2 minuten en de oplossing bereid in stap 3 werd onmiddellijk toegevoegd. Het mengsel werd afgekoeld op kamertemperatuur gedurende 15 minuten aan het tRNA vouwen correct te laten.
- De AdoMet mix (uiteindelijke concentratie 200 uM) werd bereid door het mengen van 50 pM van gemerkt AdoMet (250 uCi, 10,0 Ci / mmol, PerkinElmer) met 150 uM van niet-gemerkt AdoMet. Voor een AdoMet mix geschikt is voor 10 etikettering reacties, we gemengde 5,2 pi van niet-gemerkt AdoMet (van de verdunde oplossing), 29 pi van gelabelde AdoMet en 5,8 pi van gedestilleerd water.
- 4 pi van de AdoMet mix bereid hiervoor werd toegevoegd aan de tRNA oplossing en gedurende 2 minuten bij 37 ° C.
- Het tRNA methyltransferase, Ehmeth (1-10 uM eindconcentratie) werd toegevoegd aan de oplossing die het tRNA substraat en de gelabelde-gelabelde AdoMet cofactor. Het mengsel werd geïncubeerd gedurende 3 uur bij 37 ° C. De buizen werden regelmatig gemengd in de tijd van de incubatie door voorzichtig omkeren hen. Een kinetische curve van de enzymatische reactie werd gebouwd door het nemen van elke 20 minuten een monster (8 pi) uit het reactiemengsel over een periode van drie uur.
- Elk monster werd onmiddellijk gespot op het midden van een Whatman filter (0.5 cm diameter) en de filter was gedrenkt in een 5% TCA-oplossing en geagiteerd op ijs gedurende 10 minuten (behalve voor de AdoMet monster, tabel 2 Column E die niet mogen worden gewassen). De wasstap met 5% TCA-oplossing werd nog twee keer herhaald
- Het filter werd gewassen met 100% ethanol op ijs gedurende 10 minuten.
- Het filter was de lucht gedroogd voor een minimum van 20 minuten.
- Elke gedroogde filter werd geplaatst in een buis (specificatie) die voorheen werd gevuld met 3 ml scintillatievloeistof (CytoScint)
- De radioactiviteit die in de tRNA was met behulp van een scintillatieteller (Counter Beta Tri-Carb 2100TR).
4. Het oplossen van problemen
- Hoge waarden in kolom A of B (tabel 3), de controle monster waarden waren overeenkomstig de verwachting van de methylatie reactie in kolom C of D (tabel 3) → de filters werden niet goed gewassen.
- Lage waarden in kolom C of D (tabel 3), de methylering experimenten gelijkaardige waarden had om de controle reactie in kolom A of B (tabel 3) → het enzym was niet correct bereid, wat betekent dat er geen Adomet oprichting. Een andere optie is dat het tRNA afgebroken was en niet een geschikt substraat voor het enzym, kan dit worden gecontroleerd door het uitvoeren van de tRNA monster op een ureum acrylamide gel (zie 1.2) en kleuren van de gel met ethidiumbromide om de integriteit van het tRNA te onderzoeken .
- Lage waarden in kolom D (tabel 3) → sinds de activiteit van Ehmeth is zwakker dan hDnmt2 het enzym prestaties kunnen worden verbeterd door het verhogen van de DTT-concentratie in de opslag buffer (kan tussen de 1 tot 10 mm bereik) of aan het enzym concentratie te verhogen tot verzachten de slechte kwaliteit van het enzym.
- Lage waarden in kolom E (tabel 3) → deze kolom geeft de totale radioactiviteit van het gelabelde AdoMet waarde (aangeduid als 100%), als de waarde in deze kolom is laag betekent dit dat de AdoMet is niet langer actief en heeft verloren zijn radioactiviteit.
5. Representatieve resultaten
| Reagens | Uiteindelijke concentratie | PCR - het programma | |||||
| Gentherm PCR Buffer | 1X | 1. | 90 ° C | 2 min | |||
| MgCl 2 | 3.0 mM | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP mix | 1.2 mM | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| Template-DNA | 15,0 nM | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| Voorwaartse primer | 3,0 uM | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| Reverse primer | 3,0 uM | 2.-4. 10 cycli | 5.-7. 25 cycli | ||||
| Taq-polymerase | 0,1 U / pl | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Ad 50 ui | deksel 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 min | ||
Tabel 1: Pipetteer regeling voor PCR en PCR-programma.
| Een Negatieve controle (Ehmeth only) | B Negatieve controle (TRNA only) | C Positieve controle met menselijke Dnmt2 | D Standaard Reactie (Enz + + Subst COF) | E Totale waarde van de AdoMet op het filter | |
| tRNA | - | (3 pg) | (3 pg) | (3 pg) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 pg) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 pg) | (2,48 pg) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Totaal | 40 uL | 40 uL | 40 uL | 40 uL | Een ui |
Tabel 2:. Voorbeeld van pipetteren regeling Elke kolom in het schema is een monster.
* Zowel Ehmeth en hDnmt2 waren gefuseerd aan een GST-tag met een geschatte eiwit grootte van 62 kDa.
A-Negatieve controle die Ehmeth alleen uit.
B-negatieve controle die tRNA omvat alleen.
C-Positieve controle met menselijke Dnmt2. Dit enzym is tien keer meer activiteit dan Ehmeth
D-standaard reactie die het enzym, de ondergrond en de cofactor bevat
E-Totale waarde van de AdoMet op het filter. Deze waarde wordt gebruikt voor de berekening van het percentage van de methylgroep opgenomen.
| Een Negatieve controle (Ehmeth only) | B Negatieve controle (TRNA only) | C Positieve controle met menselijke Dnmt2 | D Standaard Reactie (Enz + + Subst COF) | E Totale waarde van de AdoMet op het filter | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Tabel 3:. Voorbeeld van waarden gelezen door de scintillatieteller Elke kolom in het schema staat een monster uit tabel 1.
Figuur 1: (A) T7 transcriptie template en primers voor in vitro transcriptie. Alle sequenties zijn geschreven in 5 'naar 3' oriëntatie. Kleurcode: zie tekst. (B) Regeling van het product de vorming tijdens de transcriptie. Het RNA transcript wordt gesynthetiseerd door T7-RNA polymerase. Hammerhead ribozym en tRNA vouwen in hun respectievelijke 2D-structuren en de ribozym splitst zich van de tRNA het verlaten van een hydroxylgroep op hun 5'-uiteinde (overgenomen van 9).
Figuur 2:. PCR-reactie controle over een 1,3% agarosegel prestained met 1X GelRed PCR-reacties op twee verschillende templates worden getoond naast een 100 basenparen plus ladder. Controles omvatten een "template only" lane en reacties waarin de reverse primer werd weggelaten.
Figuur 3:. UV-shadowing EEN PAGINA scheiding van twee transcriptie mengsels wordt weergegeven. Banden van voorloper transcripts (voor splitsing), volle lengte tRNA en hammerhead ribozym zichtbaar als schaduwen omdat ze UV-licht te voorkomen dat het bereiken van de tl-TLC plaat. Totaal tRNA van E. coli wordt gebruikt als maat marker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze presentatie, we geïllustreerd hoe de actieve componenten voor te bereiden op de maat van het tRNA methyltransferase activiteit van E. histolytica Ehmeth enzym. Deze procedure kan dienen als een startpunt en gemakkelijk aangepast aan de maat van andere tRNA-methyl. Het is belangrijk dat het volgen van de procedures die de kwaliteit en de integriteit van het tRNA substraat en van de tRNA methyltransferase eiwit te behouden om een optimale meting van de enzymatische activiteit te verzekeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation en het Rappaport Family Instituut voor Onderzoek in de Medische Wetenschappen, en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
