Assaying Oberfläche Expression von Chemosensoren in heterologen Zellen

Summary

Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung Lebendzellfärbungen, die zur Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen HEK293T bequem nachgewiesen werden können. Darüber hinaus kann es auch zum Testen auf Oberflächenexpression von anderen Chemosensoren oder GPCRs verwendet werden.

Abstract

Die lebendige Welt der Gerüche ist durch den Sinn des Geruchssinns anerkannt. Der Geruchssinn Mäusen wird durch ein Repertoire von etwa 1200 G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) ^1, die postuliert, dass flüchtige Duftmoleküle binden und Umwandlung der extrazellulären Signals in ein intrazelluläres Signal durch Kopplung mit G-Protein Gαolf vermittelt. Die Bindung des Geruchsstoffen an die Rezeptoren wird angenommen, dass eine kombinatorische Regel, dass man Geruchsstoff kann mehrere Rezeptoren binden und einen Rezeptor können verschiedene Geruchsstoffe in unterschiedlichem Maße ^{2 zu} binden folgen. Biochemische, Signal-und Ligandenbindung Studien wurden bequemerweise für die meisten GPCRs unter Verwendung heterologen Zellen. Doch der heterologen Zellen verwenden für das Studium der Geruchsrezeptoren war für eine lange Zeit ausgeschlossen, da auf die Transfektionseffizienz sie an die Oberfläche zu exportieren ist fehlgeschlagen. Saito et al haben Einzel-Membran passieren Rezeptor Transport Protein (RTP) Familie Chaperone zeigen erhöhte Expression in den Riechzellen und fungieren als Chaperone für den Verkehr Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche in heterologen Zellen, wenn co zusammen transfiziert ³ gezeigt. Zur Durchführung biochemischer Assays für Rezeptoren mit heterologen Zellen, muss man zunächst ermitteln, ob der Rezeptor zeigt robuste Oberfläche Ausdruck in der Zell-Linie. Dies kann durch die Überexpression der Rezeptoren mit dem Chaperon RTP1S durch Lebendzellfärbungen zu Fluoreszenz-Label der extrazellulären Domäne oder einen Tag in der extrazellulären Domäne ausschließlich gefolgt getestet werden. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung Lebendzellfärbungen, die zur Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen HEK293T bequem nachgewiesen werden können. Darüber hinaus kann es auch zum Testen auf Oberflächenexpression von anderen Chemosensoren oder GPCRs verwendet werden.

Protocol

1. Vorgehensweise:

Das Verfahren besteht aus drei Teilen über eine Gesamtzeit von 3 Tagen abgeschlossen: Übertragung von Zellen, Transfektion und Immunzytochemie, einen Schritt pro Tag durchgeführt. Transfer und Transfektion von Zellen in den ersten zwei Tagen muss unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden.

Tag 1: Transfer von HEK293T Zellen für Oberflächen-Expression Assays.

1. Übertragungsmedium (M10): Mix Minimum Essential Medium mit 10% (nach Volumen) fötalem Rinderserum in sterilem Zustand ergänzt.
2. Wachsen Zellen, um eine gewünschte Konfluenz in einer 100mm....

Discussion

Jeder Schritt muss sorgfältig mit einem auffälligen und markanten Oberflächenbeschmutzung sicher durchgeführt werden. Die gesamte Färbung muss in kaltem durchgeführt werden (auf Eis), und das Tablett, auf dem Deckgläschen gelegt werden muss vor gekühlt werden, um zu verwenden, um sicherzustellen, Zellen am Leben bleiben. Außerdem Fixierung am Ende der Oberfläche Färbung durchgeführt. Dies steht in krassem Gegensatz zu internen Färbung, wo Fixierung Färbung an der Zellmembran zu primären und sekundären Antikörper permeab.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Deckglas 22 X 22 mm (#1)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	72200-11
Fötales Rinderserum	GIBCO, von Life Technologies	16000
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Minimales essentielles Medium	Sigma-Aldrich	M4655	Mit L-Glutamat, Earle' s Salz und Bicarbonat
Mowiol	Calbiochem	475904
Paraformaldehyd	EMS	19208
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X	GIBCO, von Life Technologies	14025	Mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid
HEPES Pufferlösung	GIBCO, von Life Technologies	15630
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)	Cellgro	21-040-CV	Ohne Calcium und Magnesium
Poly D Lysin Hydrobromid	Sigma-Aldrich	P7280
Natriumazid	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	SX0299-1
Gewebekulturschale 35 X 10 mm	Falcon BD	353801
Trypsin-EDTA	GIBCO, von Life Technologies	25300	0,05%