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kortikale neurogenese: Übergang von advances in das labor zu zell-basierte therapien

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikale Neurogenese: Übergang von Advances in das Labor zu zell-basierte Therapien

Mein Name ist Arnold Krickstein. Ich bin der Direktor des Instituts für Regenerationsmedizin hier an der UCSF, und mein Forschungsschwerpunkt liegt in der Entwicklungsneurobiologie. Insbesondere interessieren wir uns für die frühen Phasen der kortikalen Entwicklung, untersuchen neuronale Stamm- und Vorläuferzellen und analysieren, wie diese Neuronen erzeugen, wie diese Neuronen wandern und damit beginnen, Schaltkreise im sich entwickelnden Gehirn zu bilden, insbesondere im Kortex.Nun, die Einführung der in-utero-Elektroporation war meines Erachtens eine der bahnbrechenden Technologien, die von SDO und seinen Kollegen für die Untersuchung früher Phasen der Gehirnentwicklung entwickelt wurde, da sie Gewinn- und Verlust-funktionsexperimente für eine Vielzahl von Genen ermöglicht. Und dies relativ einfach, indem man diese Gene direkt in die neuralen Stammzellen und Vorläuferzellen einführt, die während der frühen kortikalen Entwicklung Neuronen bilden. Die Technik besteht im Wesentlichen darin, DNA in Form eines Plasmids in die Hirnventrikel eines Embryos einzuspritzen und anschließend einen kurzen elektrischen Stromstoß anzulegen, der die Plasmide in die Zellen eintreiben lässt, die das Ventrikelgebiet auskleiden – also in die radialen glialen neuroepithelialen Zellen, die anschließend Neuronen und letztlich auch gliale Zellen hervorbringen.Das kann die Verwendung kurzer interferierender RNAs umfassen, die die Expression bestimmter Gene herunterregulieren oder reduzieren können, oder Sie können bestimmte Genprodukte direkt überexprimieren. Beide Experimentansätze untersuchen komplementäre Effekte auf das sich entwickelnde Gehirn. Zu den Zielmolekülen können nahezu alle Substanzen gehören, die an frühen Stadien der Gehirnentwicklung beteiligt sind oder sogar später an Phasen der synaptischen Entwicklung oder Reifung.Die Einführung dieser Technik hat bereits erhebliche Auswirkungen auf die Untersuchungen des sich entwickelnden Gehirns gehabt und verspricht, in naher Zukunft noch größere Auswirkungen zu erzielen. Die Zellen, die das Ventrikelinnere auskleiden und letztendlich alle Neuronen sowie die Gliazellen im Gehirn bilden, beginnen als neuroektodermale Zellen. Doch etwa zu dem Zeitpunkt, zu dem die Neuronen mit ihrer Entwicklung beginnen, verwandeln sie sich oder beginnen sich in eine Art von Gliazelle umzuwandeln, die als radiale Gliazelle bekannt ist.Sie bilden spezialisierte Verbindungen mit Blutgefäßen und leiten die Migration junger Neuronen. Und zu diesem Zeitpunkt beginnen sie, eine interessante Reihe verschiedener Teilungsarten durchzuführen. Sie vollziehen eine Art symmetrischer Vorläuferzellteilung, bei der sie weitere Kopien ihrer selbst erzeugen, indem sie bei jeder Teilung zwei radiale Gliazellen hervorbringen.Sie führen außerdem asymmetrische neurogene Teilungen durch, bei denen sie sich teilen, selbst erneuern und bei jedem Zellzyklus eine Tochterzelle hervorbringen, die zu einem Neuron wird. Es zeigt sich jedoch auch, dass sie einen sehr interessanten dritten Teilungstyp durchführen, der insofern asymmetrisch ist, als die Tochterzellen unterschiedlich sind. Eine davon ist eine selbst erneuerte radiale Gliazelle, während die andere eine andere Art von Vorläuferzelle wird.Wir bezeichnen sie als einen intermediären Vorläufer, der sich vom Ventrikel wegbewegt und sich anschließend gewöhnlich in einer anderen proliferativen Zone teilt, die als subventrikuläre Zone bekannt ist. Die Methode der In-utero-Elektroporation ist eine praktische Möglichkeit, diese Knockdown- oder Überexpressions-DNAs in die radialen Gliazellen während der Entwicklungsstadien einzubringen, in denen diese unterschiedliche Teilungsarten durchführen. Außerdem verwenden wir ein Retrovirus, das grün fluoreszierendes Protein exprimiert, als Linienmarker, um diesen Marker mittels Retrovirus in die Ventrikel derselben Entwicklungsstadien einzubringen und anschließend das Schicksal dieser individuell markierten Zellen verfolgen zu können, während sie sich teilen und Klone von Tochterzellen bilden.Und mittels zeitraffenden Aufnahmen, die wir in Schnittkulturen durchführen, können wir anschließend dem endgültigen Schicksal dieser Zellen folgen oder es verfolgen, während sie in den Kortex migrieren. Wurde lange Zeit angenommen, dass die ventrikuläre Zone die hauptsächliche Quelle der Neurogenese im sich entwickelnden Gehirn darstellt, so hat sich doch zunehmend die Erkenntnis durchgesetzt, dass zumindest im Embryo die subventrikuläre Zone als bedeutende Quelle erheblicher Neurogenese gilt. Wir fanden heraus, dass in der subventrikulären Zone die intermediären Vorläuferzellen, die selbst von radialen Gliazellen der ventrikulären Zone abstammen, dorthin migrieren und sich symmetrisch teilen – entweder um weitere, sich selbst erneuernde intermediäre Vorläuferzellen hervorzubringen oder durch eine symmetrische terminale Teilung Paare von Neuronen zu erzeugen, die anschließend in den Kortex wandern.Die subventrikuläre Zone erweist sich somit als eine sehr wichtige und interessante Zone der Neurogenese im embryonalen oder sich entwickelnden Gehirn. Außerdem werden diese intermediären Vorläuferzellen, während sie in dieser subventrikulären Zone verbleiben, zu multipolaren Zellen und scheinen die Fähigkeit zu besitzen, sich innerhalb dieser Zone tangential zu bewegen. Dies könnte die Streuung von Zellklonen erklären, die in früheren Studien beobachtet wurde, beispielsweise durch Walsh und S Cepco vor einiger Zeit im sich entwickelnden Kortex, ebenfalls unter Verwendung von Retroviren zur Markierung der Zelllinien dieser Zellen.Nun, beispielsweise gibt es eine Reihe interessanter Gene, die, wie sich herausstellt, entweder an der Neurogenese oder an der neuronalen Migration beteiligt sind. In unserem Labor haben wir die Gap-Junction-Proteine untersucht, also die Verbindungen, die der Bildung der bekannten Gap-Junction-Kanäle zugrunde liegen. Interessanterweise haben wir jedoch entdeckt, dass die Zellen, die entlang radialer Gliafasern wandern, diese Gap-Junctions nicht als Kommunikationskanäle nutzen, sondern vielmehr als Adhäsionsmoleküle, die es den Neuronen und wandernden Zellen tatsächlich ermöglichen, an den radialen Fasern zu haften.Und diese Studien wurden tatsächlich unter Verwendung von siRNAs durchgeführt, die die Expression spezifischer Verbindungen herunterregulierten. Zum Beispiel Verbindung 43, die sehr stark von Radio ggl sowie von deren Tochterneuronen und deren intermediären Vorläuferzellen exprimiert wird. Viele der sogenannten adulten Stammzellen, die aus dem fetalen Gehirn stammen, sind in der Tat wahrscheinlich Radio, die in Kultur expandiert werden können, wenn sie mit den richtigen Wachstumsfaktoren wie beispielsweise BFGF behandelt werden.Doch neben diesen radialen Gliazellen könnten die intermediären Vorläuferzellen ein sehr interessantes Ziel für die Stammzellforschung darstellen, da wir annehmen, dass sie tatsächlich Neuronen eines sehr begrenzten Zelltyps hervorbringen. Wenn also beispielsweise eine Strategie darin bestünde, große Mengen eines sehr spezifischen neuronalen Zelltyps herzustellen, wäre die Identifizierung und Isolierung der intermediären Vorläuferzellen, die für die Erzeugung dieses bestimmten Zelltyps verantwortlich sind, vermutlich ein weitaus besserer Ansatz, als beispielsweise die Vermehrung großer Zahlen radialer Gliazellen, die eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen produzieren könnten. Tatsächlich deuten in vitro durchgeführte Studien darauf hin, dass die meisten dieser Linien offenbar eine sogar obligatorische epitheliale oder radialgliaähnliche Phase durchlaufen, bevor sie tatsächlich Neuronen bilden.Beispielsweise ähneln die Protokolle, die Austin Smith zur Erzeugung von Neuronen oder neuralen Stammzellen verwendet hat, stark den radialen Gliazellen. Sie durchlaufen eine kinetische Kernmigration, exprimieren Transkriptionsfaktoren und Marker radiale Gliazellen und erzeugen Neuronen und Astrozyten auf eine Weise, die der von radialen Gliazellen stark ähnelt.Und in ähnlicher Weise haben Loren Ser und andere menschliche embryonale Stammzellen verwendet und festgestellt, dass diese Rosetten bilden und sich gewissermaßen zu einer neuroepithelialen Struktur in vitro selbst organisieren, bevor sie tatsächlich Neuronen erzeugen. Auch hier bestehen diese Rosetten aus Zellen, die Radioglialzellen sehr ähnlich sehen. Die Vorstellung, dass diese Radioglialzellen eine Art neuronaler Stammzelle darstellen, wird meiner Ansicht nach durch diese Art von In-vitro-Beweisen gestützt.Bevor die Neurogenese einsetzt, findet bereits eine regionale Musterung im gesamten Ventrikelsystem, also in allen Ventrikeln und tatsächlich bis hinunter zum Rückenmark, statt. Diese in bestimmten Regionen exprimierten Musterungsgene beschränken vermutlich bereits die Entwicklungspotenziale der dort gebildeten Tochterzellen. Wenn man beispielsweise erregende parametale Zellen erzeugen möchte, müsste man die dorsalen kortikalen radialen Gliazellen verwenden, die diesen Zelltyp hervorbringen; hingegen müsste man für die Produktion von Interneuronen die Zellen des Ganglienhöckers nutzen, die solche Interneuronen oder Oligodendrozyten bilden, und so weiter.Wenn Ihre Strategie in der Stammzellforschung im Hinblick auf die Behandlung einer Krankheit also darin besteht, große Zahlen von Zellen eines bestimmten Typs – etwa eines bestimmten Typs von Interneuronen oder eines bestimmten Typs von erregenden Projektionszellen – zu erzeugen, dann werden vermutlich Entwicklungsstudien, die zunehmend die Unterschiede zwischen Neurogenese in diesen verschiedenen Gehirnregionen aufdecken, Hinweise liefern, die letztendlich nutzbar sein werden, um Strategien zur Vermehrung von Neuronen eines bestimmten Zelltyps beispielsweise für Zellersatztherapien zu entwerfen. Der Begriff der Regeneration oder regenerativen Medizin deutet eigentlich auf die Fähigkeit hin, Organe zu regenerieren. Und ich denke, die meisten Menschen verstehen Stammzellen als eine Methode, um Zellen und verletztes Gewebe zu ersetzen.Doch tatsächlich glaube ich, dass die ersten Behandlungen, die aus der Stammzellenforschung hervorgehen werden, die Verwendung von Stammzellen auf andere, möglicherweise kreativere Weise beinhalten werden. Zum Beispiel die Nutzung der Stammzellenforschung im Labor, um mithilfe von Hochdurchsatzverfahren Wirkstoffe zu testen, wobei Krankheiten durch menschliche Zellen anstelle von beispielsweise Mauszellen modelliert werden. Was Zelltherapien betrifft, so denke ich, dass sie weitgehend – tatsächlich glaube ich, dass dies bereits begonnen hat – als Transportvehikel eingesetzt werden, indem beispielsweise die Fähigkeit bestimmter Stammzellen genutzt wird, in verletzte oder erkrankte Gewebebereiche zu wandern und eine Fracht abzugeben, etwa ein Gen, ein Genprodukt oder ein fehlendes Enzym und Ähnliches.Eine Anwendung, bei der die Zellen nicht in bereits vorhandene Organstrukturen integriert werden müssen, erscheint mir als der naheliegendere Ansatz. Und möglicherweise werden einige der frühen Beispiele für Zelltherapien diesen Ansatz verfolgen, anstatt eine tatsächliche Zellersetzung vorzunehmen. Die derzeitigen bundesstaatlichen Beschränkungen für die Verwendung von NIH-Mitteln für menschliche embryonale Stammzellen – außer für eine kleine Anzahl zugelassener Linien – haben die Forschung auf diesem Gebiet tatsächlich stark beeinträchtigt.Es hat einige junge Wissenschaftler vom Forschungsbereich abgehalten und verhindert, dass andere die potenzielle Nützlichkeit dieser embryonalen Stammzellen im Labor tatsächlich erforschen. Es gab Versuche, diese Einschränkungen zu lockern. Wie die meisten Ihrer Zuschauer wahrscheinlich wissen, hat der Präsident einen Gesetzesentwurf bereits vetoiert und wird, Entschuldigung, einen weiteren wahrscheinlich bald vetoieren.Unsere Hoffnung ist, dass sich diese Richtlinien ändern und es möglich wird, NIH-Mittel für die Erforschung einer ganzen Reihe neu entwickelter Stammzelllinien einzusetzen, von denen viele Vorteile gegenüber den ursprünglichen Linien haben, die vor 2001 erzeugt wurden. Doch selbst wenn das Finanzierungsverbot aufgehoben wird, würde dies vermutlich zumindest unmittelbar keine Erhöhung der Mittel für diese Art von Forschung nach sich ziehen. Und da dieser Gesetzesentwurf, der beispielsweise im Kongress vorgeschlagen wurde, kein Finanzierungs- oder Haushaltsmittelgesetz ist, wird er sich dahingehend auswirken, dass es für Forscher wie uns leichter wird, die Arbeit mit sogenannten genehmigten und nicht genehmigten Linien im selben Forschungsbereich, im selben Labor und unter Nutzung derselben Geräte oder gemeinsamer Nutzung einiger derselben Ressourcen zu kombinieren.All dies wäre eine wesentliche Verbesserung, dürfte jedoch kaum zu einem großen Zustrom an tatsächlicher Unterstützung führen, gemeint sind Forschungsdollar für derartige Aktivitäten. Dafür müssen wir meiner Meinung nach weiterhin auf private Quellen angewiesen sein, einschließlich der staatlichen Förderung, die hier in Kalifornien für Forscher im Bereich der Stammzellenforschung von großem Vorteil ist. Andere Bundesstaaten wie New York, Connecticut und Massachusetts ziehen nach und werden in Kürze eigene landesweite Initiativen zur Stammzellenforschung finanzieren.Und ich denke, dass dies ein wichtiger Motor sein wird, um die Forschung in diesem Bereich in der nahezu absehbaren Zukunft voranzutreiben, unabhängig davon, ob sich die NIH-Richtlinie bald ändert oder nicht.

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