Biolumineszierende Bildgebung der Progression von Brusttumoren in einem weiblichen Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle:
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Institut für Biowissenschaften, Universität Brasília, ²Abteilung für grundlegende psychologische Prozesse, Institut für Psychologie, Universität Brasília

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verfolgung der Tumorprogression in vivo, indem Luciferase-exprimierende Brustadenokarzinomzellen in eine weibliche Maus injiziert und Biolumineszenzsignale überwacht werden, um das primäre und metastasierende Tumorwachstum im Laufe der Zeit zu bewerten

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Zellkultur

1. Die 4T1-Zelllinie (ATCC-CRL-2539), eine murine Brust-Adenokarzinomzelle, wird in Kultur mit DMEM-Medium (Dulbeccos modifiziertes Adlermedium), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (v:v), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 U/ml), bei 37 °C und in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ aufbewahrt.
2. Transfizieren Sie die ursprüngliche Zelllinie mit dem Luc2-Gen, das Luciferase exprimiert. Dieses biolumineszierende Enzym wird konstitutiv hergestellt.

2. Tiermodell - Tumorzelltransplantation

1. Biolumineszierende, Luciferase-exprimierende 4T1-Zellen (2 × 10⁵ Zellen pro Maus) werden subkutan in den linken Rücken von Balb/c-Mäusen unter Narkose inokuliert (Ketamin und Xylazin in einer Dosierung von 80 mg/kg bzw. 10 mg/kg).
   1. Für dieses Verfahren wird die Maus vor dem Experiment durch intraperitoneale Injektion der angegebenen Anästhetika (Ketamin und Xylazin in einer Dosierung von 80 mg/kg) anästhesiert.
   2. Nach 5 Minuten Narkoseeinleitung rasieren Sie die Maus und injizieren Sie die Zellen subkutan mit 1-ml-Insulinspritzen.
      HINWEIS: Insgesamt wurden fünf 8 Wochen alte Mäuse mit einem Gewicht von jeweils etwa 25 g für die Tumorinduktion und Bildgebung verwendet.
2. Um das Tumorwachstum in vivo zu quantifizieren, bewerten Sie die tumortragende Maus durch biolumineszierende Bildgebung, indem Sie das Tumorwachstum 4 Wochen lang überwachen.
   1. Für Bioimaging-Experimente betäuben Sie die Maus mit Isofluran (2,5 % in gereinigter Druckluft verdünnt). Um das Fortschreiten des Tumors zu beurteilen, wird die Maus 4 Wochen lang einmal pro Woche mit einem Gerät abgebildet, das Biolumineszenzsignale misst.
      ANMERKUNG: Das 4T1-luc-Luziferase-Biolumineszenzsignal wurde als Parameter zur Beurteilung des Wachstums und zur Anzeige der Tumorprogression verwendet.
3. Positionieren Sie die Maus während des Bildgebungsprozesses in einer dorsalen Liegeposition innerhalb des dafür vorgesehenen Bereichs des Geräts, um die biolumineszierenden Bilder aufzunehmen.
4. Nach der Anästhesie injizieren Sie der Maus intraperitoneal D-Luciferin (100 μl; 15 mg/ml).
   ANMERKUNG: Da D-Luciferin ein Substrat für das Luciferase-Enzym ist, das bei der Spaltung Lichtphotonen erzeugt, und die 4T1-Biolumineszenz-Luciferase-Zellen dieses Enzym konstitutiv exprimieren, quantifizieren und detektieren Sie den Tumor bei lebenden Tieren.
5. Um Signale zu erkennen, nehmen Sie 20 biolumineszierende Bilder über einen Zeitraum von 20 Minuten für jedes Tier an jedem Endpunkt auf. Jedes dieser Bilder stellt das biolumineszierende Signal dar, das über einen Zeitraum von 60 s ausgesendet wird.
6. Erstellen Sie eine biolumineszierende Kinetikkurve, die das pro Minute ausgesendete Signal darstellt. Um optimale Ergebnisse für jedes Tier zu gewährleisten, zeichnen Sie die maximale Biolumineszenzemission für jeden Endpunkt auf.
7. Verwenden Sie für die Aufnahme von Biolumineszenzbildern die folgenden Parameter: Emissionsfilter offen, ohne Anregung, Binning 8, Blende 2 und Sichtfeld Typ D. Um eine Wachstumskurve zu erstellen, bilden Sie die Tiere einmal pro Woche für insgesamt 4 Wochen ab.
8. Biolumineszenz-Bildgebung - Primärtumor- und Lungenmetastasen.
   1. Um zwischen den Signalen des Primärtumors und der Lungenmetastasierung zu unterscheiden, definieren Sie mit der Software des Geräts bestimmte Regionen von Interesse.
   2. Identifizieren Sie biolumineszierende Signale an der Injektionsstelle und im thorakalen Bereich, in dem die Zellen metastasiert haben. Berechnen Sie anhand dieser Bilder den Verlauf des Biolumineszenzsignals, der stark mit der Tumorprogression korreliert.
   3. Erstellen Sie anhand von Bildern, die über mehrere Wochen gesammelt wurden, ein Wachstumskinetikprofil für die verschiedenen Tumorstellen, einschließlich des Primärtumors und der metastasierten Läsionen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
D-Luciferin	Perkin Elmer	122799	Chemisches Reagenz
Das modifizierte Eagle's Médium von Dulbecos	Gibko	Nr. A7030	Zellkultur-Medien
Fötales Rinderserum	Merck	Nr. F2442	Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturmedien
Isofluran	Cristália	NA	Anästhetika
IVIS Lumina	XR	Serie III	Ausrüstung – USA
Penizillin	Merck	Nr. P4333	Zellkultur-Antibiotikum
Phalloidin-Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	Nr. A12379	Chemisches Reagenz
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Merck	4437568	Chemisches Reagenz
Streptomycin	Merck	Nr. P4333	Zellkultur-Antibiotikum