Summary
Démonstration de la quantification des ADN double brin à l'aide Molecular Probes PicoGreen colorant et spectrophotomètre Hitachi fluorescence F-7000 équipé d'un accessoire lecteur de microplaques.
Abstract
La quantification de l'ADN, en particulier dans les petites concentrations, est une tâche importante avec un large éventail d'applications biologiques, y compris la norme tests de biologie moléculaire telles que la synthèse et la purification de l'ADN, les applications diagnostiques telles que la quantification des produits d'amplification d'ADN, et la détection de molécules d'ADN à la drogue préparations. Durant cette vidéo, nous allons démontrer la capacité du spectrophotomètre Hitachi F-7000 fluorescence équipé d'un accessoire lecteur de plaque d'effectuer une quantification Micro ADNdb utilisant Molecular Probes Quant-on kit PicoGreen réactif colorant.
Le spectrophotomètre F-7000 offre une haute sensibilité de fluorescence et les mesures à haute vitesse. C'est un système très flexible capable de fluorescence de mesure, la luminescence, et la phosphorescence. Plusieurs modes de mesure sont disponibles, y compris les longueurs d'onde, balayage temps, la photométrie et en 3-D de balayage de mesure. Le spectrophotomètre a une sensibilité de l'ordre de 50 picomoles de fluorescéine en utilisant un volume d'échantillon 300 ul de la microplaque, et est capable de mesurer des vitesses de numérisation de 60.000 nm / minute. Il a également une large gamme dynamique allant jusqu'à 5 ordres de grandeur qui permet l'utilisation des courbes de calibrage sur une large gamme de concentrations. Le système optique utilise toutes les optiques réfléchissants pour un maximum d'énergie et de sensibilité. La gamme de longueur d'onde est de 200 à 750 nm, et peut être étendue à 900 nm en utilisant l'un des proches option photomultiplicateurs infrarouge. Le système permet un contrôle de température en option pour le lecteur plaque de 5 à 60 degrés Celsius en utilisant une option de la température extérieure circulateur liquide. Le lecteur de microplaques permet l'utilisation de microplaques 96 puits, et la mesure de la vitesse de 96 puits est inférieur à 60 secondes lorsque vous utilisez le mode cinétique.
Logiciel de contrôle pour le F-7000 et lecteur de microplaques sont également très flexible. Les échantillons peuvent être mis dans des formats colonne ou une ligne non plus, et toute combinaison de puits peuvent être choisis pour les mesures de l'échantillon. Cela permet une utilisation optimale de la microplaque. De plus, le logiciel permet d'importer des exemples de configurations de micro plaque créés dans Excel et sauvegardées dans des valeurs séparées par des virgules, ou "CSV". Configurations microplaques de mesure peuvent être sauvegardés et rappelés par le logiciel pour plus de commodité et une productivité accrue. Des résultats Les données peuvent être sorties d'un rapport standard, au format Excel, ou à un programme générateur de rapport facultatives.
Protocol
1. Configuration de l'instrument
- Allumez le spectrofluorimètre et laisser chauffer pendant 1 heure.
- Utilisation d'Excel créer un fichier avec les normes et les données d'échantillon, comme le montre la figure 1 et l'enregistrer dans Comma Separated Values "CSV".
Figure 1. Normes et les données des échantillons. - Mettre en place fluorimètre comme suit:
- Cliquez sur le
bouton, cela ouvrira la fenêtre de méthode d'analyse, montre la figure 2. 
Figure 2. Fenêtre méthode d'analyse, onglet Général.
Effectuez les sélections suivantes:- Dans la "mesure", sélectionnez Photométrie du menu déroulant.
- En champ "Opérateur", entrez le nom de l'opérateur approprié.
- Il n'est pas nécessaire d'entrer des informations dans le «Règlement» le terrain. Cette option est sélectionnée automatiquement par le logiciel.
- Le "prélèvement" champ est inactif lorsque vous utilisez le lecteur de microplaques.
- Saisissez tout commentaire que vous pourriez inclure dans le rapport de la champ "Commentaires".
- Dans le "Accessoire", entrez les informations relatives aux accessoires utilisés pour ce test.
- Notez les boutons sur le côté droit de la fenêtre.
- Le bouton "Charger" permet de charger les méthodes d'analyse précédemment enregistré.
- Le bouton "Sauvegarder" permet la mise à jour d'un ensemble de paramètres de test ou d'une méthode d'analyse préalablement enregistrés et chargés, en utilisant le même nom.
- Le "Enregistrer sous" bouton permet d'enregistrer un nouvel ensemble de paramètres de test ou d'une méthode d'analyse sous un autre nom désiré.
Figure 3. Fenêtre méthode d'analyse, onglet quantification.- Dans le "type de quantification", sélectionnez onde. Ceci indique la lecture de fluorescence seront effectués en utilisant la longueur d'onde sélectionnée.
- Dans le «type d'étalonnage", sélectionnez une vue st.
- Dans le champ "Nombre de longueurs d'onde", sélectionnez 1.
- Dans l '"unité de concentration", entrez ng / mL.
- Laisser les cases non sélectionnées pour "Calibrage manuel» et «courbe de force grâce à zéro".
- Dans le "chiffre après la virgule", sélectionnez 2.
- Dans la "limite inférieure de concentration", entrez 0.
- Dans le "champ de concentration limite supérieure, entrez 10000.
Cliquez maintenant sur «l'Instrument» onglet et effectuez les sélections suivantes.
Figure 4. Fenêtre de méthode d'analyse, onglet Instrument- Dans le mode "données" de terrain, sélectionnez fluorescence.
- La «vitesse à découper« champ est inactif en ce moment, il n'est utilisé que pour des mesures de phosphorescence.
- Dans le mode "Wavelength", sélectionnez la fois fixe WL.
- Dans le "EX / WL1" entrez 480nm.
- Dans le «EM / WL1" entrez 520nm.
- Tous les autres champs sous EX et EM sont inactifs en ce moment.
- Dans la "fente EX" champ de sélectionner 5.0nm du menu déroulant.
- Dans le «EM fente" sur le terrain de sélectionner 5.0nm du menu déroulant.
- Laisser désélectionné la case en face de la "tension PMT 1-1000V" sur le terrain.
- Dans la "tension PMT", sélectionnez 700V à partir du menu déroulant.
- Dans le «calc Auto statistique. Numéro de" champ de sélectionner 2.
- Dans la «Réplique» champ de sélectionner 1.
- Dans le «Temps d'intégration" champ de sélectionner 0.1s. </ Li>
- Dans le "retard" entrez ou sélectionnez 0.
Figure 5. Fenêtre de méthode d'analyse, onglet Moniteur.- Dans «l'axe Y", "Max:", sélectionnez 10000
- Dans «l'axe Y", "Min:« champ, sélectionnez 0.
- Sélectionnez la case à gauche du "traitement de données ouvertes après l'acquisition des données".
- Laisser désélectionné la case à la gauche du "rapport d'impression après l'acquisition des données", sauf si vous voulez un rapport qui sera imprimé automatiquement après les lectures sont terminées.
Figure 6. Fenêtre de méthode d'analyse, onglet Rapport.- Dans la "sortie", sélectionnez Imprimer rapport du menu déroulant. Vous pouvez également sélectionner "Utiliser Microsoft Excel» si vous voulez que les données exportées vers Excel, ou la «feuille Générateur Utilisez Imprimer» si vous utilisez le complément optionnel sur Report Generator programme qui permet de générer des rapports personnalisés de fait.
- Cliquez sur les cases des éléments que vous voulez être inclus dans le rapport.
- Pour enregistrer tous les paramètres sélectionnés dans les différents onglets de la «Méthode d'analyse" fenêtre, cliquez à nouveau sur l'onglet "Général" et de les enregistrer sous un nom de fichier et dans un endroit où vous pourrez les trouver pour une utilisation future, et cliquez sur le " OK "pour fermer cette fenêtre.
- Ceci achève la mise en place des paramètres de test instrument.
- Maintenant, nous allons mettre en place le lecteur de microplaques.
- Cliquez sur le
bouton, ce qui portera la fenêtre de configuration du MPR sur le dessus.
Figure 7. Fenêtre d'installation MPR, onglet Plate.- Cliquez sur la position A1 et faites glisser la souris pour E1, puis cliquez sur le
bouton. Cela permet de sélectionner les postes à être utilisée pour les normes. Ces positions seront surlignés en couleur verte. - Maintenant nous avons besoin pour sélectionner F1 postes à H3 pour les échantillons. Cliquez et faites glisser la souris à partir de F1 position, à la position H3 et puis cliquez sur le
bouton, cela va mettre en évidence les positions de couleur jaune. - Ensuite, répétez la même opération pour des postes A2 à l'E3, pour sélectionner les postes pour les mesures d'échantillons.
- Maintenant, nous allons charger le fichier Comma Separated Variable (CSV) préparé à l'avance avec les normes et les informations de l'échantillon.
Figure 8. Fenêtre d'installation MPR, onglet Informations bien.- Puis cliquez sur le
bouton. Une fenêtre de l'explorateur Windows s'ouvre qui, comme le montre la figure 9, ce qui permettra à localiser la «Eh bien information.csv" fichier et de le charger. 
Figure 9. Chargement des informations puits d'échantillon.
Après le chargement du "information bien" fichier, "l'information Well" sera comme le montre la figure 10
Figure 10. Chargé d'information de l'échantillon ainsi.
- Cliquez sur le
bouton, cela ouvrira la fenêtre de méthode d'analyse, montre la figure 2. 
bouton, ce qui portera la fenêtre de configuration du MPR sur le dessus. 
bouton. Cela permet de sélectionner les postes à être utilisée pour les normes. Ces positions seront surlignés en couleur verte. 
bouton, cela va mettre en évidence les positions de couleur jaune. 
bouton. Une fenêtre de l'explorateur Windows s'ouvre qui, comme le montre la figure 9, ce qui permettra à localiser la «Eh bien information.csv" fichier et de le charger. 
2. Préparation Picogreen échantillon d'essai
- Préparer 1X tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) en ajoutant 1 ml de tampon 20 X TEà 19 ml dI H 2 O.
- Préparer la solution de réactif PicoGreen en ajoutant 50 pl 200 X PicoGreen réactif à 9,95 ml de tampon 1 X TE.
- Préparer des normes (Lambda ADNdb) en faisant des dilutions successives du stock ADNdb (100 pg / mL). D'abord préparer une solution de 50 ug / ml ADNdb en ajoutant 25 uL de stock ADNdb (100 pg / ml) et 25 uL 1 x tampon TE. Puis la préparation des solutions standard en ajoutant les volumes indiqués d'ADN double brin et un tampon comme indiqué dans le tableau ci-dessous:
Concentration des ADNdb Volume d'ADN double brin Volume de tampon 1 ug / ml 20 ul de 50 ug / ml ADNdb 980 uL 1 X tampon TE 0,1 pg / ml 100 uL de 1 pg / mL ADNdb 900 pi X 1 tampon TE 0,01 pg / ml 100 uL de 0,1 pg / mL ADNdb 900 pi X 1 tampon TE 0,001 g / mL 100 ul de 0,01 pg / mL ADNdb 900 pi X 1 tampon TE
3. Mesure des normes et de fluorescence de l'échantillon
- Pipeter 150 uL de chaque norme dans les puits A1-E1 d'une plaque de 96 puits, par la figure 7, et selon le tableau suivant:
Eh bien Standard A1 1 ug / ml B1 0,1 pg / ml C1 0,01 pg / ml D1 0,001 g / mL E1 1 X tampon TE - Pipeter 150 uL échantillons inconnus dans des puits F1 à H3, illustré à la figure 7
- Verser la solution PicoGreen préparés à l'étape 1.2 dans une auge conçu pour une utilisation pipette multi-canaux. Utiliser une pipette multi-canaux pour livrer 150 uL solution PicoGreen aux puits A1-H3. Mélanger la solution et les normes doucement avec la pipette.
- Placez la plaque dans la zone sombre et attendre 2-5 minutes pour une réaction à se développer.
4. Les résultats représentatifs
Une courbe de calibration de bons est évaluée en utilisant les différents paramètres fournis par le logiciel F-7000 sur la mesure des normes et le calcul de la courbe d'étalonnage par le logiciel.
Le coefficient de détermination indique la qualité de l'ajustement des normes mesurées et la courbe de calibration calculé. Le plus proche de cette valeur est à "1", le mieux l'ajustement de la valeur mesurée et la courbe de calibration.
Si la valeur est loin d'être «1», les normes doivent être ré-évalués, préparés à nouveau, ou l'aptitude de la courbe de calibration changé.
La figure 11 montre un exemple d'une courbe d'étalonnage avec un coefficient de détermination calculée = 0,99993, obtenus pour la quantification des ADN double brin à l'aide PicoGreen colorant.
Figure 11. Exemple de courbe de calibration ADNdb.
Discussion
Pipetage prudent lors de la préparation des échantillons, ainsi que l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence stable et sensible est essentielle pour obtenir de bons résultats et reproductibles.
Dans le cas du spectrophotomètre de fluorescence utilisé pour ce test, il est suggéré d'utiliser le volume 300 uL de l'échantillon final dans le lecteur de microplaques. Baisser le volume diminue la sensibilité, et un plus grand volume peut provoquer une contamination croisée entre les puits.
Disclosures
Luis A. Moreno et Kendra L. Cox sont employés par Hitachi America Technologies Haute qui produit l'instrument utilisé dans cet article.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
