RNA-Interferenz wurde als sehr effektiv erwiesen, um Genfunktionen in Analyse Drosophila Trachealen Entwicklung. Ein detailliertes Protokoll von Jiang Labor verwendet werden, um dsRNA zu fliegen Embryonen knockdown Genexpression injizieren dargestellt. Diese Technik hat das Potenzial für das Screening von Genen für die Gewebe-und Organentwicklung in erforderlich Drosophila.
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Methodenartikel
RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Genetisches Screening ist eine der leistungsstärksten Methoden zur Einblicke in komplexe biologische Prozess 1. Im Laufe der Jahre viele Verbesserungen und Werkzeuge zur genetischen Manipulation geworden in Drosophila 2 zur Verfügung. Bald nach der ersten Entdeckung von Frie-und Mello 3, dass doppelsträngige RNA verwendet werden, um knockdown die Aktivität einzelner Gene in Caenorhabditis elegans, der RNA-Interferenz (RNAi) gezeigt, dass eine leistungsstarke Reverse genetische Ansatz bieten, um Genfunktionen in Drosophila Orgel Entwicklung zu analysieren war sein 4, 5.
Viele Organe, einschließlich Lunge, Niere, Leber und Kreislauf-System sind von verzweigten röhrenförmigen Netzwerken zusammen, dass der Transport lebenswichtigen Flüssigkeiten oder Gase 6, 7. Die Analyse von Drosophila tracheale Bildung bietet ein exzellentes Modellsystem zur Morphogenese von anderen röhrenförmigen Organen 8-Studie. Die Berkeley Drosophila-Genom-Projekt hat hunderte von Genen, die in den Tracheen exprimiert werden aufgedeckt. Zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen der tube formation, ist die Herausforderung, die Rolle dieser Gene in trachealen Entwicklung zu verstehen. Hier haben wir beschrieben, eine detaillierte Methode der dsRNA-Injektion in Drosophila-Embryo den Zuschlag einzelner Gen-Expression. Wir haben erfolgreich niedergeschlagen endogenen dysfusion (Dys) Genexpression durch dsRNA Injektion. Dys ist ein bHLH-PAS-Protein in trachealen Fusion exprimiert, und es ist für die tracheale Filiale Fusion 9, 10 erforderlich. dys-RNAi vollständig eliminiert dys Ausdruck und führte in trachealen Fusion Defekt. Diese relativ einfache Methode stellt ein Werkzeug, um Gene für tissure und Organentwicklung in Drosophila requried identifizieren.
Protokoll
1. Embryo-Entnahme
- Set up Käfigen bei 25 ° C mit 2-4 Tage alten w 1118 flies.Grape Saft Platten pro Stunde während des Tages verändert, um die Entnahme der Eizellen über 1-2 Tage vor der Sammlung synchronisieren
- Sammeln Embryonen für 1 Stunde bei 25 ° C
- Schneiden Sie ein rechteckiges Stück von Traubensaft Agar, leicht in der Mitte mit einer Rasierklinge geschnitten, lassen Sie eine Zeile in der Agar-
- Verwenden Sie ein Metall-Sonde Embryonen aus Traubensaft Platte Transfer zu Ihrem Stück Traubensaft Agar, Linie sie in einer geraden Linie mit dem Embryo längere Achse bei 45 Grad-Winkel auf der Linie in der Mitte des A....
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Diskussion
Die dsRNA Injektionsverfahren hier anwesend ermöglicht eine sehr sensible und schnelle Analyse der Genfunktion in Drosophila trachealen Entwicklung. Diese Methode kann möglicherweise angewendet Genfunktion für andere Gewebe-und Organentwicklung zu analysieren.
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich bei Stephen Crews für dysfusion cDNA, Dys-Antikörper und w 1118 fliegt danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Halocarbon-Öl 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III-Pikopumpe | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Mikropipetten | Fisher Scientific | 21170M | |
| Mikrolader | Eppendorf | 930001007 |
Referenzen
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
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Nachdrucke und Genehmigungen
