Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Zusammenfassung

Neurogenese im postnatalen Gehirn hängt Wartung von drei biologischen Ereignisse: die Proliferation von Vorläuferzellen, die Migration von Neuroblasten, sowie die Differenzierung und Integration neuer Neuronen in bestehende neuronale Schaltkreise. Für die postnatale Neurogenese im Riechkolben, werden diese Ereignisse innerhalb von drei anatomisch verschiedene Domains getrennt: Verbreitung weitgehend erfolgt in der subependymale Zone (SEZ) der Seitenventrikel, Migration Neuroblasten durch den rostralen wandernden Strom (RMS) durchlaufen, und neue Neuronen zu differenzieren und Integration innerhalb der Riechkolben (OB). Die drei Domänen dienen als ideale Plattformen, um die zellulären, molekularen und physiologischen Mechanismen, die jedem der biologischen Ereignisse deutlich regulieren zu studieren. Dieses Papier beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Hirngewebe optimiert, in denen die extrazelluläre Bedingungen genau imitieren die in vivo-Umgebung für die Migration von Neuroblasten. Wir zeigen, dass unser Assay für eine einheitliche, orientiert und schnelle Bewegung der Neuroblasten innerhalb der RMS bietet. Dieser Assay wird als sehr geeignet für die Untersuchung von Zell-autonome und nicht autonome Regulation neuronaler Migration durch die Nutzung Cross-Transplantation Ansätze von Mäusen auf unterschiedlichen genetischen Hintergründen.

Protokoll

I. Verfahren

Die folgenden Techniken sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, in einer Sterilbank mit sterilisierten Instrumente.

Vorbereitung der Glasboden Gerichte für organotypischen Schnitten

1. Gerichte müssen in sterilen Umgebung zubereitet und mit sterilisierten Instrumente.
2. A 150 &mgr; l Tropfen Scheibe Medium (siehe Rezepte) befindet sich im Zentrum der Glas-Unterteil der Schale mit Sorgfalt, um Luftblasen in das Medium zu vermeiden platziert.
3. Mit einer Einwegspritze mit einer 23-Gauge-Nadel, multiple Leimpunkte (Rubber Cement - Elmer, cat # E904) ausgestattet sind, auf dem Platz Rande neben dem runden Deckglas, dass das Zentrum der Kulturschale nimmt gelegt, wobei aber die eine Seite unglued für Fluid-Austausch (Abbildung 1). Die aufgeführten Art Kleber ist nicht toxisch auf die Scheiben oder die Zellen, wie in diesem Protokoll angewendet. Es muss gegeben zu vermeiden, dass keine Kleber auf dem Deckglas, da dies treffen auf und behindern die Abbildung der Scheiben später. Ein Nucleopore Membran (Durchmesser 25mm, Porengröße 8.0μm - Whatman, cat # 110614) ist auf der Oberseite des Deckglas gelegt, mit dem Leimpunkte, um ihn zu sichern. Dies sollte mit Hilfe eines Mikro-Pinzette, während sichergestellt wird, dass keine Luftblasen zwischen dem Deckglas und der Membran eingeschlossen.
4. 1 ml Medium Scheibe auf der Oberseite der Membran. Die Gerichte werden in einem Inkubator für 30 Minuten und dann auf Eis gelegt, bis zur Verwendung.

Extraktion von frühen postnatalen Gehirn

Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn Scheiben von jungen postnatalen Mäusen (P1-P10) hergestellt.

1. Welpen sind unheilbar narkotisiert (überdosiert) durch Isofluoran oder anderen anerkannten Methoden. Der Kopf kann mit 70% Ethanol besprüht werden, um die Sterilität zu erhöhen, gefolgt von einer raschen Enthauptung mit einer scharfen Schere.
2. Der Kopf ist durch Einklemmen des Unterkiefers mit Mikropinzette stabilisiert. Die Haut wird in Längsrichtung vom Hals bis die Schnauze ausgeschnitten. Der Schädel ist in Längs-und anterior ausgehend von der Cisterna magna geschnitten, indem man 1 medial und 2 seitliche Schnitte (eine auf jeder Seite - 2A). Es sollte darauf geachtet, den Kontakt mit den zugrunde liegenden kortikalen Gewebes zu minimieren, wie der Schädelbasis Klappen Entfernung aus dem Gehirn entfernt werden.
3. Zur Verbesserung der Stabilität des Gewebes während Vibratom Schnitte sind die seitlichen-die meisten Aspekte des Gehirns durch zwei sagittal Teilstücke entfernt. Die kaudalen Bereich des Gehirns ist auch durch einen Schnitt an der rostralen Basis des Kleinhirns (Abbildung 2B) entfernt.
4. Die beiden Hemisphären sind, indem sie einen glatten Schnitt entlang der Mittellinie Spalt getrennt, und die beiden Hemisphären sind sorgfältig schöpfte aus dem Schädel und legte, medialen Oberfläche nach unten, in einem Einbettform (Abb. 2C-D).

Schnitte von der Host-Hirn-

1. Die beiden Hemisphären im Einbettform werden sofort mit zerlassener 3% niedriger Schmelzpunkt DNA-grade Agarosegel (Fisher, cat # BP1360-100) gelöst in Gewebeaufbereitung Puffer, der bei 37 ° C (siehe Rezepte) beibehalten wird abgedeckt. Nach 2 Minuten für eine Stabilisierung auf einem flachen horizontalen Fläche noch Verhärtung der Agarose zu gewährleisten, werden die Formen auf Eis positioniert, um die Einstellung abzuschließen.
2. Sobald das Gel mit den Hemisphären gesetzt ist, wird er aus der Form entnommen und getrimmt, so dass 2-3mm von Gel um das Hirngewebe.
3. Das Gel-eingebetteten Gewebe wird dann auf dem Probenteller des Vibratom montiert, mit der medialen Oberfläche auf und sicherte mit Cyanacrylat-Klebstoff (Krazy Kleber oder gleichwertig). Darauf geachtet werden muss, um nur minimale Mengen von Kleber gelten, da zu viel haben toxische Wirkungen auf Scheiben und Migration von Zellen. Zu viel Leim an den Seiten des Blocks wird auch behindern das Schneiden, wodurch mögliche Schäden im Gewebe.
4. Die Scheibe ist in der Vibratom Probenwanne mit eiskaltem Gewebeaufbereitung Medium gefüllt installiert.
5. Das Gewebe wird geschnitten auf 150 um Dicke, mit der Vibratom Geschwindigkeit auf einem langsamen bis mittleren Bereich eingestellt (wird auf der Vibratom abhängen, und damit müssen unabhängig für optimale Ergebnisse ermittelt werden). In unsere Hände ist die Schwingungsfrequenz optimal, wenn auf maximal eingestellt. Die ersten paar Scheiben verworfen werden kann.
6. Sobald die RMS-haltigen Scheiben sind von der Klinge (der RMS ist sichtbar mit bloßem Auge als graue U-förmige Struktur, die sich von der SEZ, die OB) veröffentlicht, sind sie vorsichtig aus dem Gel Form gehänselt, und schaufelte mit einem kleinen Schlitzschraubendreher Spachtel. Die Scheiben werden auf der Nucleopore Membran der Glasboden-Schalen mit Scheibe Medium (Abbildung 3A-B) platziert. Ein typisches frühen postnatalen Gehirn der Maus wird Ertrag von ca. 2-3 RMS Sektionen pro Hemisphäre, wenn sie bei 150 pm geschnitten. Es ist wichtig, dass der Umgang mit den Scheiben ist auf ein Minimum reduziert, da sie sehr zerbrechlich sind. Die Gerichte mit den Scheiben werden dann in einen Inkubator überführt.

Donor GehirnSchneiden und RMS-Transplantation

1. Donor Gehirn (Hirn Ausdruck fluoreszierenden Reporter bei der Migration von Neuroblasten) sind im Schnitt bei 250μm Dicke und Scheiben sind in eiskaltem Gewebeaufbereitung Puffer gesammelt.
2. Scheiben sind sofort unter einem Binokular mit Epifluoreszenz Fähigkeit gelegt, und die RMS wird sanft mikrodissezierten mit Mikropinzette. Eine Zange dient dazu, die Scheibe zu stabilisieren, während der andere wird verwendet, um kleine Schnitte in der RMS machen, bis sie von der Scheibe löst. Die herausgeschnittenen RMS wird dann in kleine Explantate (ca. 200-500 &mgr; m im Durchmesser) vor der Transplantation geschnitten.
3. Glass-bottom Schalen mit Host-Scheiben auf dem Nucleopore Filter positioniert werden aus dem Brutschrank entnommen und unter dem Binokular. Mit sichtbarem Licht, ist die RMS eindeutig identifiziert und einen kleinen Schnitt in das erste Segment des RMS gemacht.
4. Mit einer Pipette mit einem 20 ul Spitze ausgestattet ist, ist einem einzigen Spender RMS Explantation der eingeschnittenen Seite in den Host-RMS übernommen. Das Explantat wird sanft in der Einschnitt geschoben, um den Kontakt zwischen den 2 Gewebe herzustellen. Um dies zu gewährleisten Kontakt stabil ist, werden die Explantate leicht zwischen den Scheiben und den Nucleopore Membran gedrückt.
5. Sobald alle Host-Scheiben mit dem RMS transplantiert werden, sind die Gerichte in den Inkubator für mindestens 1 Stunde zurück, damit die Abschnitte auf der Membran absetzen. Neuroblasten sollten anfangen, aus dem Explantat in den Wirt RMS nach ca. 1-2 Stunden wandern.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Migration

1. Der Glasboden-Gerichte werden aus dem Brutschrank bebrütet die Kammer unter dem Mikroskop (Abbildung 3C) übertragen. Fluorescent Neuroblasten können in Abständen zwischen 0 bis 10 Minuten, je nach Art der gewünschten Analyse abgebildet werden. Zum Beispiel haben wir Bild Zytoskeletts während der wandernden Zyklus von einzelnen Neuroblasten, indem Sie unsere Abständen von weniger als oder gleich 2,5 Minuten. Allerdings sind die Populationsdynamik wie Orientierung und Geschwindigkeit der Migration besser in Intervallen von 5 bis 10 Minuten erfasst. Die Wahl der Ziele ist sehr variabel in Abhängigkeit von der Marke des Mikroskops. Für eine Nikon C1 konfokalen Mikroskop, so finden wir, dass die 20x trockene Linse (Nikon Pan Fluor, NA 0,75, WD 0,35) am besten geeignet für unsere Analysen ist. Für optimale Ergebnisse auf dieser konfokalen System, ist die Lochkamera eine mittlere Größe (60 um Durchmesser) eröffnet. Für die meisten geeignete Zugverhalten ist Bildgebung von Zellen tief in die Dicke der RMS beschränkt, mindestens 20 um weg von einer der Schnittflächen der Scheibe. Laserleistung sollte so optimiert, dass es ein Minimum ist, sondern dass die Details der einzelnen Neuroblasten sichtbar bleiben.
2. Sobald die Bildgebung ist abgeschlossen Scheiben können mit eiskaltem fixiert werden, und frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd, immungefärbt und montiert auf Folien für die weitere Bildgebung. Da wir nicht beschichten unsere Membranen mit anhaftendem Substrate wie Laminin zu tun, die Scheiben in der Regel davon schweben von der Membran, wenn sie in der Färbung Puffer eingetaucht sind. Sections abgebildet werden unter Wahrung ihrer 150 pm Dicke. Es ist auch möglich, Kryokonservierung und frieren die Scheiben und die Verwendung eines Kryostaten auf dünneren Abschnitte der Original-Scheiben zu erhalten. Allerdings wird dies in einem Anstieg der Inzidenz von Artefakten in der Färbung als auch zu verändern, die Integrität des Gewebes führen.

II. Material / Ausrüstung

Vorbereitung der Glasboden Gerichte für organotypischen Schnitten

• Kleine Spritzen (1 ml)
• 23-Gauge-Nadeln
• Nucleopore Track-Etch-Membran - Durchmesser 25mm, Porengröße 8.0μm - Whatman, cat # 110614
• Glass Bottom Kulturschalen - 35mm Petrischale, 14mm Microwell, Nr. 1,5 Deckgläser - MATTECH, cat # P35G-1,5-14-C
• Rubber Cement - Elmer, cat # E904
• Basal Medium Eagle - Gibco, cat # 21010
• 1M Hepes (pH 7,4)
• 1M D-Glucose
• 100 mM CaCl ₂
• 100 mM MgSO ₄
• 1M NaHCO ₃
• dH ₂ O
• 200 mM L-Glutamin
• Penicillin-Streptomycin

Brain-Extraktion und Einbettung

• Betäubungsmittel (Isofluoran, etc.)
• Mikrowellenofen
• Low Melting Agarose - Fisher, cat # BP1360-100
• Krazy Kleber - cat # KG585
• Peel-A-Way Einweg Einbettschälchen (R-40) - 22mmx40mm rechteckige, 20mm tief - Polysciences, cat # 18646C

Gehirn-Schnitte und RMS-Transplantation

• Vibratom - Leica VT1000S und alle Zubehörkomponenten für Stück Vorbereitung
• 10x Hanks Balanced Salt Solution - Gibco, cat # 14185
• Microdissecting Pinzette # 5 - Roboz, cat # RS-4976
• Mikrospatel - Fisher, cat # 21-401-15
• Stereomikroskop

Zeitraffer-Bildgebungorganotypischen Schnitten

• Befeuchteten Inkubator, 5% CO ₂
• Inverses Mikroskop mit Inkubatorkammer und Fernverkehr Arbeitsziele (NA von 0,6 oder höher) ausgestattet

III. Rezepte

Pufferlösung für Gewebedissektion und in Scheiben schneiden Vorbereitung (tissue Praparationspuffer)

Stammlösung	Volumen	Finale Concetration
10x HBSS	50 mL	1X
1M Hepes (pH 7,4)	1,25 ml	2.5mm
1M D-Glucose	15 mL	30 mM
1M CaCl 2	0,5 ml	1mM
1M MgSO 4	0,5 ml	1mM
1M NaHCO 3	2 mL	4mm
dH 2 O	430,75 mL

Filter mit einer 0,2 um Filter und lagern bei 4 ° C sterilisieren

Kulturmedium für organotypischen Schnitten, Gewebetransplantation und Imaging-(slice medium)

Stammlösung	Volumen	Endkonzentration
Basal Medium Eagle	35 mL
Tissue Praparationspuffer	12,9 ml
1M D-Glucose	1,35 ml	20 mM
200 mM L-Glutamin	0,25 ml	1mM
Penicillin-Streptomycin	0,5 ml	100units / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin

Filter mit einer 0,2 um Filter und lagern bei 4 ° C sterilisieren

Vorbereitung der Low-Schmelzpunkt Agarosegel

Low-Schmelzpunkt Agarose wird in Gewebeaufbereitung Puffer bei 0,3 g / ml in einem 50 mL konischen Rohr (siehe Rezepte) verdünnt. Das Rohr wird in Schritten von 5-10 Sekunden auf High-Power-Mikrowellen. Anzahl der Stufen ist abhängig von Volumen, für 10 ml, drei Schritten (10-8-5 Sekunden jeweils) sollte ausreichen. Das Rohr Kappe schraubte vorsichtig zwischen Heiz-Schritten, um den Luftdruck ab und verhindert Explosion der Röhre. Vorsicht geboten, als die Röhre Inhalte werden sehr heiß werden. Sobald die Agarose vollständig gelöst ist, wird das Rohr in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 5 Minuten gehalten, um damit die Temperatur vor stabilisieren zu bedienen. Längere Exposition auf Raumtemperatur härtet das Gel. Obwohl diese so weit wie möglich vermieden werden müssen, können gehärtete Gel erwärmt und werden wieder eingeschmolzen für den sofortigen Einsatz innerhalb von 24 Stunden die ersten Vorbereitungen.

Immunhistochemie auf organotypischen Schnitten

Nach Bildgebung auf dem konfokalen Mikroskop, kann Scheiben über Nacht bei 4 ° C fixiert werden mit 4% Formaldehyd in PBS. Die Schnitte werden dann über Nacht bei 4 ° C blockiert, in 10% Ziegenserum mit 1% Triton X (Sigma, Cat. # S26-36 bis 23) in PBS gefolgt von einer Inkubation über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 ° C. Fluoreszenz-markierten Ziege Sekundärantikörper für Visualisierung (alle 1:1000 verdünnt, 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur) verwendet. Labeled Scheiben gründlich 5-6 mal mit eiskaltem PBS vor der Montage auf Glas-Objektträger und Deckglas gewaschen.

IV. Repräsentative Ergebnisse

Unsere organotypischen Kultur-Protokoll wurde gründlich getestet und optimiert, dass seit einigen Jahren für Konsistenz in der Migration Muster und Orientierung. Analyse von Zellen Auswanderung aus Explantaten aus Mäusen gewonnen, in denen der Ausdruck der rot fluoreszierendes Protein, Td-Tomate, unter der Nestin-Promotor (Nestin-Td Tomaten) induziert wird, zeigt hochorientierten und schnelle Migration von tdTomato + Neuroblasten in den Wirt RMS ( Abbildung 4A). High-Vergrößerung Zeitraffer-Analyse zeigt eine hervorragende Auflösung der gesamten Länge eines wandernden Neuroblasten während einer 20-minütigen Sitzung Bildgebung (Abbildung 4B).

Slices mit Donor Td-Tomate + Zellen wurden fixiert und immunhistochemisch für verschiedene zelluläre Komponenten innerhalb der RMS. GFAP + Astrozyten und CD31 + Blutgefäße offenbart wurden unter Verwendung von fluoreszierenden Immunhistochemie (Abbildung 5A). High-Vergrößerung Analyse der Scheiben für das Zytoskelett Proteine ​​Aktin und Tubulin gefärbt zeigen uneinheitliche Expression dieser Komponenten von einer Zelle in der Mitte der Migration (Abbildung 5B).

Antikörper verwendet inDiese Beispiele: Kaninchen-anti-RFP (Abcam, 1:250), Kaninchen-anti-GFAP (Dako, 1:1000), Ratte anti-CD31 (BD Pharmigen, 1:100), Maus-anti-Aktin (Santa Cruz, 1: 500), Kaninchen-anti-Tubulin (Sigma, 1:1000), Ziege anti-Maus-Cy3 (Chemicon, 1:1000), Ziege Anti-Kaninchen-AlexaFluor 647 (Invitrogen, 1:1000), Ziege-anti-Ratte AlexaFluor 488 (Invitrogen , 1:1000), Ziege Anti-Kaninchen-AlexaFluor 488 (Invitrogen, 1:1000).

Abbildung 1. Vorbereitung der Glasboden-Gerichte für organotypischen Schnitten. Multiple Leimpunkte sind rund um die runde Glas-bottom Komponente der Schale (rot) gelegt, so dass eine Seite offen für den Austausch von Medium von der Unterseite des Filters. A 150 &mgr; l Tropfen Scheibe Medium ist in der Mitte des Deckglas platziert. Ein Nucleopore Membran (blau) wird dann angewendet, glänzenden Seite nach unten, während sichergestellt wird, dass keine Luftblasen zwischen dem Deckglas und der Membran eingeschlossen sind. Ein Milliliter der Scheibe Medium (grau) ist auf der Oberseite der Membran verteilt und Gerichte sind bei 37 ° C vor dem Gebrauch.

Abbildung 2. Brain-Gewinnung und Aufbereitung für das Schneiden. (A) Der Schädel ist durch Einschneiden der Kopfhaut vom Hals bis zu den Rüssel (gestrichelte Linie entlang der Mittellinie) ausgesetzt. Der Schädel wird dann längs und vorne beginnend an der Cisterna magna geschnitten, indem man 1 medial und 2 seitliche Schnitte (eine auf jeder Seite; 2A). (B) Die seitliche-die meisten Aspekte des Kortex und der kaudalen Bereich des ZNS reseziert, um die Stabilität des Gewebes während Vibratom Schnitte zu verbessern. (CD) Die beiden Hemisphären sind dann getrennt und medial dem Gesicht nach unten in einem Einbettform vor der Anwendung von 3% Agarosegel in Gewebeaufbereitung Puffer gelöst.

Abbildung 3. Brain-Schneiden-und Cross-Transplantation. (A) Die Wirtsgewebe ist 150 um Dicke geschnitten, und die RMS-haltigen Abschnitte sind sorgfältig positioniert flach auf den Nucleopore Membran der kalten Glas-bottom Gerichte. (B) Donor Gehirn (Hirn Ausdruck fluoreszierenden Reporter in die RMS) geschnitten werden bei 250μm Dicke, und die Scheiben sind in eiskaltem Gewebeaufbereitung Puffer gesammelt. Der Spender RMS ist mikrodissezierten und in kleine Explantate. Mit einer Pipette mit einem 20 ul Spitze ausgestattet, werden die einzelnen RMS Explantate auf einem eingeschnittenen Seite in den Host-RMS übernommen. (C) Nach 1-2 Stunden Inkubation, Geschirr, eine inkubiert Bühne auf einem konfokalen Mikroskop übertragen und Migration erfasst mit Zeitraffer-Bildgebung. Die mikroskopische Aufnahme ist eine repräsentative low-Vergrößerung Bild eines typischen Scheibe (grau) eingerichtet 1 Stunde nach der Transplantation (rot Explantation von tdTomato + RMS eines Spenders Maus, rot gepunkteten Linien umreißen die RMS in den Host-Scheibe).

Abbildung 4. Migration von Neuroblasten aus Explantaten in den Wirt RMS. (A) Nestin-tdTomato + Neuroblasten (rot) aus den Explantaten in die Host-RMS (gepunktete grüne Linie) 1 Stunde nach der Transplantation zu migrieren. tdTomato + Zellen Invasion der RMS der Host organotypischen Schnitten bewegen sich in einer stark orientierte und schnelle Art und Weise weg von der SEZ und in Richtung der OB. (B) Die wandernden Zyklus in High-Power-Zeitraffer-Aufnahmen eines Neuroblasten über etwa ein beobachtet werden können 20 Minuten Zeit. Balken = 10 um.

Abbildung 5. Immunhistochemische Beurteilung der organotypischen Schnitten. Explantierte Neuroblasten (rot) wurden in der Mitte der Migration fest 12 Stunden nach der Transplantation. (A) Fluorescent immunhistochemische Färbung der Scheibe zeigt ein dichtes Pool von GFAP + Astrozyten (blau) und CD31 + Blutgefäße (grün) gestreut innerhalb der RMS des Host-Scheibe. (B) Das Zytoskelett einer isolierten tdTomato + Migration Zelle (rot) in einem Host-RMS wird durch Co-Immunfärbung mit Antikörpern gegen Aktin (blau) und Tubulin (grün) enthüllt.

Diskussion

Neuronale Migration in der RMS ist ein wesentlicher Bestandteil der postnatalen Neurogenese im Riechkolben ^1. Migration durch die RMS erfolgt in einer Ebene tangential zur Oberfläche des Gehirns. Tangential wandernden Neuroblasten unterscheiden sich von radial wandernden Zellen auf die Lage ihrer Vorläuferzellen Quelle sowie die divergente Schicksal ihrer endgültigen neuronalen Produkte ^{1, 2, 3.} Die relativ reine Population von tangential wandernden Zellen in der postnatalen RMS macht diese anatomi...