Hefekolonie Embedding-Methode

Summary

Eine Methode zur Einbettung von Hefe-Kolonien ermöglicht Schnitte für Licht-und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll erlaubt die Bestimmung der Verteilung der sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen innerhalb Kolonien bietet ein neues Werkzeug zum Verständnis der Organisation von Zelltypen innerhalb eines Pilz-Gemeinschaft.

Abstract

Strukturierung von verschiedenen Zelltypen im Embryo ist ein wichtiger Mechanismus in Metazoen Entwicklung. Gemeinschaften von Mikroorganismen, wie Kolonien und Biofilmen zeigen auch Muster von Zelltypen. Zum Beispiel in der Hefe S. cerevisiae, sind sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen nicht gleichmäßig in Kolonien verteilt. Die funktionelle Bedeutung der Strukturierung und der molekularen Mechanismen, die diese Muster zugrunde liegen, sind noch weitgehend unverstanden.

Eine Herausforderung in Bezug auf die Untersuchung Muster von Zelltypen in Pilzkolonien ist, dass im Gegensatz zu vielzelligen Gewebe, Zellen in Kolonien relativ schwach miteinander verbunden. Insbesondere sollten Sie Pilzkolonien nicht die gleichen umfangreichen Ebene der extrazellulären Matrix in den meisten Geweben gefunden. Hier berichten wir über eine Methode zum Einbetten und Schneiden Hefekolonien, dass das Innere Muster von Zelltypen zeigt in diesen Kolonien. Die Methode kann verwendet werden, um dicke Abschnitte vorbereiten (0,5 μ) sinnvoll für die Lichtmikroskopie und dünne Schnitte (0,1 μ) für Transmissions-Elektronenmikroskopie werden. Asci und pseudohyphal Zellen können leicht von eiförmige Hefezellen mittels Lichtmikroskopie unterschieden werden, während die innere Struktur dieser Zellen können mit Hilfe von EM.

Die Methode basiert auf umliegenden Kolonien mit Agar-Agar, infiltrieren sie mit Spurr das Medium, und dann Schnitte basieren. Kolonien mit einem Durchmesser im Bereich von 1-2 mm eignen sich für dieses Protokoll. Zusätzlich zu visualisieren das Innere der Kolonien, erlaubt das Verfahren die Visualisierung der Region der Kolonie, dass die zugrunde liegenden Agar eindringt.

Protocol

1. Colony Isolierung und Fixierung

1. Inkubieren 300 Kolonien auf Agar-Medium für die angegebene Zeit (eine isolierte Kolonie sollte 1-2 mm im Durchmesser).
2. Entfernen Kolonie (face up) und die zugrunde liegenden Medium mit einem schmalen Spachtel.
3. Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf einem Objektträger mit 1 mL Pipetman Spitze und sofort Platz Kolonie auf Agar Gesicht, bevor es erstarrt.
4. Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf Kolonie und damit zu verfestigen.
5. Tragen Sie Handschuhe für alle Schritte für den Rest dieses Protokolls
6. Trimmblock mit Rasierklinge und legen Sie sie in einem 3,5 ml Borosilikatglas Schr....

Discussion

Die vorgestellte Methode zeigt, die inneren Strukturen der Kolonien. Da die Methode ist effektiv bei der Bestimmung Muster von Zelltypen in einer Reihe von S. cerevisiae-Stämme mit unterschiedlichen Morphologien Kolonie, und auch in einer verwandten Spezies S. paradoxus ^5, ist das Verfahren auch am ehesten auf eine breite Palette von Pilzen und anderen Mikroorganismen zu arbeiten.

Ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Methode ist, um sicherzustellen, dass die gesa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Osmiumtetroxid	Elektronenmikroskopie Sciences	RT 19152
Silikoneinbettungsformen	Fisher Scientific	NC 9975029
Cycloaliphatisches Epoxidharz	Elektronenmikroskopie Sciences	RT 15004	ERL 4221
Epoxidharz	Elektronenmikroskopie Sciences	RT 13000	DER 736
Nonenylbernsteinsäureanhydrid	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften RT 19050	NSA
2-Dimethyl amin– thanol	Electron Microscopy Sciences	RT 13300	DMAE
Eindeckmedien	KPL Inc	71-00-16
Rotierendes Rad	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Mikrotom	Leica Microsystems	Ultracut S