Summary
在这里,我们描述一个优化的多重逆转录定量PCR(QRT - PCR)结合起来作为一个时间和成本效益高通量的microRNA(miRNA)的表达水平的筛检工具的微流体平台的协议,尤其是当样本数量有限的工作。
Abstract
在底层开发,组织homoeostasis和疾病的关键进程的miRNA广泛参与,导致之间涌动的研究和制药界的兴趣。要研究的miRNA,它是必不可少的microRNA水平的量化准确,稳健的。通过比较野生型的小分子RNA的缺陷小鼠胚胎干细胞(MESC),我们揭示了在先前公布的多重定量RT - PCR技术的准确性和鲁棒性的缺乏。在这里,我们描述了一个优化的方法,包括净化远离以前的多重步骤之前单一的实时检测,大大提高了该技术的准确性和鲁棒性的过度引物。此外,我们将解释如何执行一个微流体芯片在纳升量的技术,大大降低试剂成本,并允许时间有效的高通量的miRNA表达谱。
Protocol
1。 RNA的提取:在单层细胞培育出
(按照制造商的协议,用TRIzol。)
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# |
TRIZOL解决方案 | Invitrogen公司 | 15596-018 |
异丙醇 | Sigma - Aldrich公司 | 1907年至1964年 |
氯仿 | Sigma - Aldrich公司 | 彗星2432 |
乙醇 | ||
核糖核酸酶自由水 |
同质化
- 均质直接在培养皿中的细胞,加入1毫升Trizol法解决方案,每10厘米的2盘面积,漩涡周围的Trizol法和吸管向上和向下的钢板,以确保全覆盖。
相分离
- 孵育匀浆样品在室温下5分钟。
- 转移到一个标记管,加0.2毫升氯仿制成每1ml TrizolSolution管用手大力摇晃15秒。
- 在室温下孵育3分钟。
- 样品离心15分钟,在12000 XG 2 ° C。离心后的混合物分离成一个较低的相冲,一个相间和无色的上层水相,其中包含的RNA和总的Trizol溶液的体积应为60%。
RNA沉淀
- 转让的水,含有RNA的阶段到一个新的,标记管。
- 每1毫升的Trizol溶液中加入0.5毫升异丙醇沉淀的RNA。
- 样品在室温下孵育10分钟。
- 2 ° C。离心10分钟,在12000 XG
RNA洗
- 离心后,弃管的上清液。
- 加入至少1毫升75%,每1毫升的Trizol溶液,涡旋乙醇洗涤RNA的颗粒(侧面和底部的管)。
- 2 ° C。离心5分钟,在7500 XG
RNA的洗脱
- 弃上清,再次离心1分钟。卸下过多的液体。
- 空气干燥颗粒为5-10分钟。
注:以上干RNA是难以溶解。 - 在核糖核酸酶自由水溶解沉淀吹打的解决方案和下孵育10分钟,在55 ° C。
- 测量RNA的浓度(A260/280的比值)使用Nanodrop™分光光度计。
- 储存在-80 ° C,直到准备使用。
2。 RNA的提取:血清
(以下mirVana巴黎工具包制造商的协议修改米切尔等。 )
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# | 评论 |
MIR瓦纳巴黎套件 2X变性解决方案 酸酚:氯仿 miRNA的清洗解决方案1 miRNA洗涤液的2 / 3 | Ambion公司 | AM1556 | 修改协议 |
2 - 巯基乙醇 | Sigma - Aldrich公司 | M7522 | |
乙醇 | |||
DEPC处理水 |
化学制备:
- 2 - 巯基乙醇的加入375μL2X变性液,拌匀。
- 21毫升100%的乙醇添加到miRNA的洗涤液1。
- 100%的乙醇添加40毫升的miRNA洗涤液的2 / 3。
样品制备:
- 在冰上解冻血清样本。
同质化
- 混合2X变性液等体积(300μL)(应在室温下)和旋涡300μL的样品。
- 孵育5分钟,冰的混合物。
- 添加量的酸酚:氯仿等于样品裂解液加2X变性液(600μL)的总体积。
重要提示:不要使用缓冲溶液在于顶部的酸酚:氯仿。 - 旋涡混合60秒。
- 在室温下离心15分钟最大转速(> 10,000 XG)。离心后,上层水相,相间和较低的有机相的混合物分离成。
- 删除aque类层之上(300 - 500μL,包括任何proteinacious的“朦胧”层)。
- 像以前一样重新提取水层,再加入氯仿。
重要信息:第二次提取的水层是常规体积小(250μL) 。注意卷的恢复。
终审RNA隔离(总RNA的制备)
- 预热(95℃)无核酸酶水。
- 100%的乙醇必须在室温下。
最后RNA隔离(总RNA)
- 1.25卷100%的乙醇添加到回收的水相(例如,如果被收回300μL,加入375μL乙醇),调匀。
- 对于每个样本,放入收集管中的一个滤芯。
- 滴入的过滤器在裂解。
- 离心机(10,000 XG),30秒,丢弃流过,再次离心30秒到同一个收集管和更换滤芯。
RNA洗
- 应用700μLmiRNA的清洗液1滤芯和离心15秒,丢弃收集管流过,并更换成相同的收集管滤芯。
- 申请为15秒500μL的miRNA洗涤液的2 / 3,离心,丢弃的流量通过,并重复第二个500μL洗涤液的2 / 3。
- 弃掉1-2分钟流过干自旋。
- 放置在一个新的收集管滤芯,适用于100μL核糖核酸酶自由水(95℃),接近第2分钟孵化。
- 离心1〜2分钟恢复的RNA。
- 贮存于-80℃直至使用。
3。浓度RNA解决方案(5X)
(以下制造商的协议)
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# |
单片机离心式过滤装置,Ultracell YM - 3 | Millipore公司 | 42404 |
DEPC处理水 |
设备:单片机Ultracell YM - 3,截止SS和DS核苷酸:10
体积:所需的重新集中RNA溶液的体积是依赖于实验设计,并应包括对照实验。
- 插入小瓶单片机样品水库和水库移液器解决方案。
注:请勿触摸膜。 - 185分钟离心机在4 °最大14000 C X G.
注:位置对转子与打击乐队的小瓶。 - 移液器核糖核酸酶自由水所需的量(如20μL)上水库,水库的地方倒到一个新的瓶和3分钟旋转4 ° C最大3000小工
- 贮存于-80℃直至使用。
4。反转录
(由唐等协议。进行了修改。)
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# | 评论 |
高容量的cDNA归档套件 10倍的cDNA归档缓冲区 的dNTP(100毫米) 莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV) 逆转录酶(50 U /μL) | 美国应用生物系统公司 | 4368814 | 修改协议 |
RNaseOUT(40 U /μL) | Invitrogen公司 | 10777019 | |
X - plex的反向茎环结构的引物组合(40纳米)* | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列* |
DEPC处理水 |
反应体积:5.5μL
注:最终的茎环结构的引物浓度应1-5纳米(2纳米)。
准备主混合(每反应体积)如下:
1。 DEPC -水 | 1.959μL |
2。 10X RT -缓冲区 | 0.55μL |
3。核糖核酸酶抑制剂(40 U /μL) | 0.0715微升 |
4。的dNTP(100毫米) | 0.275μL |
5。 X - plex的反向茎环结构的引物组合(40纳米)* | 0.275μL |
6。 MMLV RT(50 U /μL) | 0.369μL |
- 宓X和短暂离心。
- 2μL样品添加3.5μL主混合。
- 执行以下的RT反应:
16℃30分钟,由60个周期,在20 ° C 30秒,42 ° C为30秒,50 ° C为1秒,最后85 ° C时5分钟灭活MMLV - RT,4 ° C∞ 。 - 储存在-20 ° C,直到使用。
*反向的茎环结构的引物名单可以发现在http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
5。预扩增(预PCR)
(由唐等协议。进行了修改。)
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# | 评论 |
的dNTP(100毫米) | 美国应用生物系统公司 | 4368814 | 高第。 cDNA的归档包。 |
2个通用PCR扩增预混试剂NoAmpErase UNG | 美国应用生物系统公司 | 4324018 | |
X - plex的正向引物组合(450纳米)* | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列* |
通用反向引物(100微米) | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列2 |
AmpliTaqGold聚合酶(5 U /μL) | 美国应用生物系统公司 | 4311806 | |
MgCl 2的 (100毫米) | |||
DEPC处理水 |
反应体积:27.5μl(22μlMM +5.5μlRT -产品)
注:前置放大是必要的,以提高信号强度,尤其是当起始RNA浓度是有限的。输入RNA水平决定前PCR循环的最佳数量。由于相同的相对效率,每个PCR循环最终产品的浓度增加一倍。由于一些miRNA将更加高效表达,避免过度骑自行车。然而,在放大,可能会导致检测灵敏度的损失,尤其是在低水平表达的microRNA。 12预扩增循环,使用100ng的总RNA,在我们的手中出现足够了。使用作为起始原料,经12个周期结果在检测的miRNA的水平,但15个周期似乎要优于血清。最后,3卵母细胞(约400 PG每个卵母细胞3的总RNA),16预扩增周期的开始,成功地使我们屏幕上的microRNA的表达水平4。
*正向引物名单,可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
准备主混合(每反应体积)如下:
1。 2个通用MM | 13.75μL |
2。 DEPC -水 | 0.792μL |
3。 MgCl 2的 (100毫米) | 0.55μL |
4。的dNTP(100毫米) | 1.1μL |
5。 X - plex的正向引物组合(450纳米) | 3.06μL |
6。通用RP(100μmol) | 1.375μL |
7。 AmpliTaqGold聚合酶(5 U /μL) | 1.375μL |
- 混合,短暂离心。
- 加入22μL法师组合,以每5.5μLRT - 产品。
- 执行以下预PCR反应:
95℃10分钟,55 ° C为2分钟,10 - 18 95 ° C的周期为1秒和65 ° C为1分,4 ° C∞。
6。前- PCR产物的纯化
10%的原生聚丙烯酰胺凝胶净化大小选择
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# |
40%丙烯酰胺/双解决方案 | Bio - Rad公司 | 161-0144 |
TEMED | Bio - Rad公司 | 161-0801 |
10 bp的DNA阶梯 | Invitrogen公司 | 10821-015 |
SYBR黄金核酸凝胶染色 10,000 ×集中在DMSO | Invitrogen公司 | S11494 |
糖原(20毫克/毫升) | 罗氏公司 | 10 901 393 001 |
缓冲器EB | ||
10%Ammoniumpersulfate(APS) | ||
10缓冲区 | ||
6X橙G | ||
DEPC处理水 | ||
ddH2O |
A.凝胶法制备
为了使10%的聚丙烯酰胺的混合物添加10毫升
1。 DDH 2 Ø | 6.5毫升 |
2。 10X TBE | 1毫升 |
3。聚丙烯酰胺(40%) | 2.5毫升 |
4。 APS(10%) | 80μL |
5。 TEMED | 4μL |
- 准备DNA梯状:
- 0.5μL10 bp的DNA阶梯
- 4.5μL缓冲液(EB)
- 1μL6X橙G
- 每27.5μL预- PCR产物5.5μL6X橙G。
B.运行凝胶
- 与150V运行55-60分钟的凝胶。
注:溴酚蓝为指示剂,用20bp区域运行。
C.染色凝胶
- 摇床25分钟的凝胶染色使用SYBR金。
注 :SYBR的黄金对光敏感。
D.切割凝胶
- 切出60-80 BP前PCR产物带,并转移到标记管。
注:为低RNA输入预PCR产物带可能不可见。 - 粉碎凝胶带(如管离心管)。
E.重新提取的cDNA
- 加入300μl10缓冲区在37 ° C时4小时的肩。
- 一个标记收集管传输流体,添加另外300μL10缓冲区凝胶含管孵育4 ° C在肩过夜。
- 吸剩下的液体,转移到标记之前收集管,并注意总回收量。
F.乙醇沉淀
- 室温100%的乙醇添加3卷。
- 添加0.5μL糖原(20毫克/毫升)。
- 涡街流量计。
- 干冰放置至少2小时,或在-80 ° C过夜。
- 自旋在4 ° C离心30分钟以沉淀的cDNA在。
- 转储液,添加700μL室温75%乙醇和10分钟的旋转。
- 转储液和自旋为5分钟。
- 吸了10分钟,而不会干扰颗粒和空气干燥上清。
- 干净的水溶解沉淀。
注:集中cDNA的解决方案所需的量依赖于实验设计应包括对照实验。
7。前- PCR产物的纯化
其次是引物酶消化纯化离心柱(制造商协议)
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# |
ExoSAP - IT | USB - Affymetrix公司 | 78250 |
MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen公司 | 28004 |
注:独家酶清理成功切除引物在我们手中,但也导致了部分降解的预扩增产物,可能是由于部分短的产品随着温度升高80 ° C时的灭活步骤变性酶。避免热灭活和使用离心柱从酶反应的PCR产物直接净化删除任何无产品退化的底漆。
- 5μL后的PCR产物与2μLExoSAP - IT混合。
- 37 ° 15分钟,以降低其余的引物和核苷酸的彗星。
- 加入5的缓冲PB卷1体积的PCR反应和混合,如果pH值指示剂,我已添加到缓冲器PB,检查混合物的颜色是黄色。
- 在提供的2ml收集管放置在一个合适的机架的MinElute列。
- 应用范例MinElute列和1分钟的离心。
- 流丢弃,MinElute列到同一管内,并添加750μL缓冲体育MinElute列洗1分钟离心机。
- 丢弃流过,并在同一管内放置MinElute列回。离心机以最大的速度增加1分钟列。
- 放置在一个干净的1.5 ml离心管的MinElute列。
- 以洗脱DNA,加入10μLDEPC处理水的膜的中心,让站在列1分钟,然后CENtrifuge为1分钟。
8。 Fludigim 96.96 QRT - PCR分析
试剂名称 | 公司 | PROD /猫# | 评论 |
Fluidigm公司96.96动态阵列套件 96.96动态阵列 96.96控制线液 20X载入试剂 | Fluidigm公司 | ||
混合的 通用反向引物(1μM) 正向引物(1μM) TaqMan探针(0.2微米) | 综合DNA技术 | 自定义 | 序列(1) |
2个通用PCR扩增预混试剂 NoAmpErase UNG | 美国应用生物系统公司 | 4324018 | |
吐温 |
1。促发的96.96动态阵列国际金融公司
- 注入到每个芯片上的累加器的控制线液(150μL)。
- 将进入国际金融公司(集成流体通路)控制器芯片和运行总理(136x)脚本到芯片的控制线液总理。
注:芯片需要使用24小时后打开包装。请务必不要对泄漏物控制线液,因为控制芯片上,或在进气口线流体使芯片无法使用。芯片需要吸60分钟内加载。
2。准备样品
2.1前的样品制备
在一个一次性的塑料管,结合下面的表格,使样品预混合(每进气道卷)的组成部分。
2X的TaqMan通用的master mix | 2.5μL |
20X载入试剂 | 0.25μL |
注:最终成交量为2.75μL,为移液器盘盈免除损失
2.2样品制备
在96结合以及格式每个样品与样品预混合(每进气道卷)。
前样品混合 | 2.75μL |
样品 | 2.25μL |
注:涡和离心96孔板中,简要地收集液。
每个入口5μL的最后一卷,吹打考虑损失准备成交量略高。
2.3准备13X检测
- 使用96孔板准备13X检测。 1X浓度在下面的表格,规模达13倍。
通用反向引物 | 1微米(1个) | 2序列 |
正向引物* | 1微米(1个) | * |
基因特异性的TaqMan探针# | 0.2微米 | # |
*正向引物名单,可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
#TaqMan探针的名单可以发现在 http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm
- 在浓度为0.25%,最终吐温吐温13X检测一个新的96孔板等分结合
注:每个入口的最终体积为5μL,准备足够的体积(5.5μL)期间损失量转移到。 - 拌匀,避免气泡,短暂离心收集液。
3。载入芯片
注:为了使样品和检测,确保芯片的正确定位正确加载。很方便的槽口对准左上角。
确保所有检测样品溶液混合,然后再加载芯片。这是方便做在96孔板和旋转,然后再加载芯片板。注意芯片的吹打,以供日后参考地图。
未使用的示例入口处应填2.75μL样品混合和2.25μLDNA自由水。
应填写未使用的检测进气口与2.5μL检测装载试剂和2.5μl水。
不要走过去的第一站,同时吹打,以避免引入气泡。
- 加载样品和检测(五后olume每个入口:5μL)运行负载混合脚本(136x)脚本来加载到芯片的样品和检测。
- 脚本已经完成后,删除从ICF控制器芯片。
- 剥离加载芯片底部的蓝色保护膜。
- 删除任何从芯片表面的灰尘颗粒或碎片。
4。 96.96定量RT - PCR检测
- BioMark系统传输芯片,并使用以下的扩增条件:
55℃2分钟,95 ° C为10分钟,40个周期为95 ° C为1分15秒和55℃。 - 按照制造商的数据采集软件的协议。
5。使用的qPCR分析软件
经过RT - PCR技术的专有软件提供的扩增曲线,每口井的热图和CT值。请参阅数据分析软件手册。
9。代表性的成果:
图1。图解实验的工作流程。所示是一个一步一步的多重定量RT - PCR协议的描述,包括从多重反转录(步骤C)和多路前置放大器的过度引物的净化(步骤E)(步骤d)前实时检测(步骤F),在纯化的QRT - PCR的cDNA模板。 FP:microRNA的具体正向引物,URP:通用反向引物,R - SLP:小分子RNA的特定反向茎环结构的引物。
点击这里为一个较大的图像。
图2。聚丙烯酰胺凝胶净化。QRT - PCR的模板后前 PCR - PCR产物的大小乐队专门在WT样本,但没有microRNA的缺陷DGCR8 - / -或Dicer酶- / -样本(箭头)后96复杂RT和12周期的前置放大。请注意,非特定产品来源不明(箭头)和过量引物在所有样本中发现(星级)。
图3。净化多重前置放大后,大大提高了定量RT - PCR结果的精度比较的相对表达水平的WT MESC)DGCR8 - / - (缺乏规范的microRNA)MESC揭示1)更多的小分子RNA的检测和2)假阳性的损失/ - -在DGCR8信号的背景后,净化了引物- PCR产物。二)经纯化后,双方DGCR8的相对表达水平- / - / WT 和 Dicer - / - / WT显示假阳性信号的损失,并允许适当的分类罕见DGCR8 独立/ Dicer的依赖性小分子RNA(miR - 320的, - 484,-877)5。
图4。 Fluidigm公司的高通量定量RT - PCR检测miRNA表达谱。屏幕截图96.96 Fluidigm公司QRT - PCR mircoRNA分析屏幕为前列腺癌患者血清miRNA的水平的改变。实时定量PCR分析软件提供的扩增曲线,色码热图和循环阈值(CT)。
Discussion
miRNA是短(18-24个核苷酸),非编码RNA,从而调节基因表达的转录后由两个不稳定的信使RNA(mRNA)的抑制其翻译。6,至少有三分之一的人类基因组包含保守的miRNA约束力的网站在他们的3'UTR和多能性,增殖和凋亡基因的miRNA明显的相互作用,表明在细胞命运的决定,组织动态平衡和癌症等疾病的重要贡献6,7因此,准确的microRNA表达谱广泛。兴趣。
为了测试发布的多重定量RT - PCR检测miRNA 表达谱协议2,我们作为阴性对照的小分子RNA的缺陷MESC。 DGCR8 - / -细胞缺乏规范的microRNA,而Dicer的- / -细胞缺乏规范和非canoncial micoRNAs 8,9
比较野生型水平的MES DGCR8 - / -细胞,我们发现几个表示没有检测到野生型细胞11 10小分子RNA的缺乏准确性。有的甚至呈相对较低的表达水平的基因敲除细胞(图3a)。我们推测,可能会造成大量的引物进行两个连续的多重步骤之前RT定量单一(RT和前PCR)缺乏准确性。然而,多重预扩增是必要的,以提高信号强度,尤其是当起始RNA浓度是有限的。净化远离本地聚丙烯酰胺凝胶电泳(图2)的大小选择的引物- PCR产物,我们可以证明,通过检测microRNA和假阳性信号的损失都DGCR8在精度显着改善 - / -和 Dicer - / -另外的背景(图3a和3b)修改后的QRT - PCR的方法,允许适当的分类DGCR8罕见的独立 / Dicer的依赖小分子RNA( 图 3b )11。因此,一个额外的步骤,以净化过量引物离预PCR产物是明显的优势,尤其是当使用大型复用底漆,每样本集。
预扩增周期的最佳人数是由输入RNA浓度。不能下或平衡overamplify应遵循的具体实验的详情。
与千余名已知的microRNA,使用标准的384孔板未必最广泛的microRNA分析,尤其是在比较多个样本。 Fluidigm公司的动态阵列国际金融公司使,用移液步骤和所需化学显着下降,以96对96纳升规模(6.7 NL)(9216反应)在一次实验中在不同的小分子RNA的个别样品测试。对于每一个运行的分析软件提供的扩增曲线,色码热图和循环阈值(CT)。同时大规模的分析,降低实验的差异,并允许平均表达式的值正常化,这出执行其他正常化战略,利用小分子RNA控制的。
相比市售384预先指定的TaqMan探针的良好平台,与定制引物的高通量分析平台的结合提供了实验的灵活性高。
优化的多重定量RT - PCR技术相结合的方式,用动态数组平台成功地允许我们同时屏幕改建48个前列腺癌患者血清中384的miRNA(图4)的水平,并没有控制穗(即合成的microRNA)的数据正常化。 11
尽管增加从样品制备到分析结果步骤,描述的方法是一个时间和成本效益的高通量方法简介miRNA表达水平的大样本集,即使在有限的起始原料。
Disclosures
艾伦米尔是Fluidigm公司的雇员。否则,我们没有披露的财务利益。
Acknowledgments
我们想感谢Blelloch实验室评论文本。这项工作是由来自美国国立卫生研究院(K08 NS48118和R01 NS057221),加州再生医学研究所(CIRM)(种子补助RS1 - 00161,新教师奖RN2 - 00906)和皮尤慈善信托基金到RB和调频支持Wissenschaftlich Urologische GESELLSCHAFT EV。
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