Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Gewebetransplantation Technik, die entwickelt, um die Signal-und Strukturierungs-Eigenschaften der Oberfläche cephalica Ektoderm während kraniofazialen Entwicklung Test war.

Abstract

Die Zugänglichkeit der Vogelembryonen hat dazu beigetragen, experimentelle Embryologie verstehen das Schicksal der Zellen während der Entwicklung und der Rolle der Gewebe-Wechselwirkungen, die Strukturierung und Morphogenese von Wirbeltieren (z. B. ^{1, 2, 3, 4)} zu regulieren. Hier zeigen wir eine Methode, die diese Zugänglichkeit nutzt die Signalisierungs-und Strukturierungs-Eigenschaften der ektodermalen Gewebe während Gesichts-Entwicklung zu testen. In diesen Experimenten, schaffen wir Wachtel-Küken ⁵ oder Maus-chick ⁶ Chimären durch Transplantation der Oberfläche cephalica Ektoderm, dass der Oberkiefer von Wachteln oder Maus deckt entweder auf der gleichen Region oder einer ektopischen Region Hühnerembryonen. Die Verwendung von Wachteln als Spendergewebe zur Transplantation in chicks wurde entwickelt, um die Vorteile eines nucleolar Marker in Wachteln, aber nicht chick Zellen tragen, sodass Ermittler zu hosten und zu Spendergewebe ⁷ unterscheiden. Ebenso ist eine sich wiederholende Element in der Maus-Genom und ist ubiquitär exprimiert, das uns erlaubt, Host-und Spendergewebe in Maus-chick Chimären ⁸ unterscheiden. Die Verwendung von Maus Ektoderm als Spendergewebe wird erheblich erweitern unser Verständnis dieser Gewebe-Wechselwirkungen, denn dies wird es uns ermöglichen, die Signalisierung Eigenschaften des Ektoderms aus verschiedenen mutierten Embryonen zu testen.

Protocol

1. Vorbereiten des Spendergewebe

1. Bereiten Kulturmedien, schärfen Glas Stifte, schärfen Wolfram Nadeln.
2. Sammeln Embryo aus der Schale, in eiskaltem PBS waschen.
   1. Mit einer 10 ml-Spritze und eine 18-Gauge-Nadel entfernen 1,0 ml Albumin aus dem spitzen Ende der Eierschale.
   2. Machen Sie ein kleines Loch an der Oberseite des Gehäuses mit dem Punkt der Schere, und schneiden Sie dann eine kreisrunde Öffnung, um den Embryo aussetzen
3. Entfernen Sie den Kopf und Ort in DMEM (serumfreien, Raumtemperatur)
4. Dissect frontonasale Prozess aus dem Embryo (oder anderer Geber vor Ort wie Ober-oder Unterkiefer-Prozess)
5. Digest in 2.4U / mL Dispase in PBS auf Eis 20 Minuten
6. Abdeckung Gewebe mit DMEM mit 1% BSA, um die Verdauung zu stoppen
7. Verwenden geschärft Wolframnadel zu trennen Ektoderm, Mesenchym und Neuroektoderms
8. Shop Transplantatgewebes in DMEM 1% BSA auf Eis, bis Gastgeber ist bereit für die Transplantation

2. Vorbereiten des Host-

1. Expose des Embryos
   1. Mit einer 10 ml-Spritze und eine 18-Gauge-Nadel entfernen 1,0 ml Albumin aus dem spitzen Ende der Eierschale.
   2. Machen Sie ein kleines Loch an der Oberseite des Gehäuses mit der Spitze einer Schere. Legen Sie ein Stück Klebeband über das Loch, und schneiden Sie dann eine kreisrunde Öffnung, um den Embryo aussetzen.
2. Mit 2 Paar Zangen, fassen Sie das Amnion und sanft reißen ein Loch zu machen.
3. Drehen Sie den Kopf, indem sie einer Pinzette auf das rechte Auge und Druck. Halten Sie den Kopf ruhig, verwenden Sie eine Wolfram-Nadel an den Host-Ektoderm zu entfernen, um das Transplantat aufnehmen.
4. Übertragung des Transplantats an den Host mit einer Glaspipette.
5. Position des Transplantats, die entfernt Ektoderm zu ersetzen. Legen Sie ein Glas pin in jeder Ecke des transplantierten Gewebes, um das Transplantat an Stelle pin. Um Glas Stifte, ziehen eine Mikrokapillare Rohr zu einer feinen Spitze über ein Alkohol Flamme.
6. Legen Band dicht über dem Loch und zurück Embryo in den Inkubator für angemessene Zeit für die Analyse.
7. siehe auch: ⁹

3. Repräsentative Ergebnisse:

Um zu beurteilen, Chimären, sollte Embryonen erhoben und verarbeitet werden für die Analyse der Verteilung der Gastgeber und Spender Gewebe. Für den Nachweis von Wachtel-Zellen, Immunhistochemie mit dem QcPN Antikörper (beschrieben in: ³⁾ eingesetzt wird, und für die Erkennung von Maus-Zellen, in situ Hybridisierung auf Paraffinschnitten ist ⁶ verwendet. Spenderzellen sollte das Epithel beschränkt werden, und es sollte keine Beweise für Spender mesenchymalen Gewebe (Abbildung 1). Die Anwesenheit von isolierten Spenderzellen in das Mesenchym zeigt die Anwesenheit von Kontaminationen Neuralleistenzellen die jede morphologische Interpretation durch den Einfluss dieser Zellen auf viele Aspekte der Entwicklung des Gesichtes (z. B. ¹⁰⁾ zu verwechseln ist. Einmal überzeugt, dass die Graft-Technik frei von kontaminierenden Mesenchym ist, können weitere morphologischen und molekularen Ergebnissen Maßnahmen verwendet werden, um die Chimären zu beurteilen. Für unsere Zwecke, entdeckten wir das Vorhandensein von ektopen Knorpel und Knochen, die zu Vervielfältigungen im Oberkiefer, die durch die transplantierten Gewebe (Abbildung 2), und molekularen Veränderungen in den mesenchymalen Geweben in Reaktion auf die veredelten Ektoderm induziert wurden (Abbildung 3) entsprach ^5,6.

Abbildung 1. Beurteilung des Chimärismus (A) Anti-QcPN Färbung wird verwendet, um Wachteln Zellen in Wachtel-Küken Chimären zu erkennen. Es gibt keinen Beweis der Färbung in das Mesenchym. (B) In-situ-Hybridisierung wird verwendet, um die Expression von SINE B2-Transkripte in der Maus-chick Chimären zu erkennen. Expression ist auf das Ektoderm aus dem Transplantat beschränkt.

Abbildung 2. Trichromfärbung zeigt Vervielfältigung des Oberkiefers Skelett in (A) Wachtel-Küken Chimäre, und (B) Maus-chick Chimären.

Abbildung 3. Das Ektoderm regultes Genexpression im Mesenchym. (A) Normal BMP7 Ausdruck in dem Mesenchym eines Hühnerembryo (radioaktive in situ Hybridisierung mit positives Signal Pseudo-rot in Adobe Photoshop). (B) BMP7 Ausdruck ist in dem Mesenchym neben dem Transplantat (Pfeil) in chimären Embryonen induziert.

Discussion

Mit dieser Transplantation Methode konnten wir feststellen, dass die Ektoderm Signalisierung Informationen, die dorsoventrale Polarität und proximodistalen Erweiterung des Oberkiefers regelt enthält. Die Ähnlichkeit der Ergebnisse bei der Verwendung von Wachteln oder Maus Ektoderm, und die Erhaltung der molekularen Signale in diesem Gewebe unter vielen Arten ^6,11 bedeutet, dass eine hoch konservierte Signalisierung Zentrum unter den Wirbeltieren ist. Darüber hinaus haben andere Forscher ähnliche Techniken ver...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Tektronix, Inc.
DMEM	University of California - San Francisco	CCFDA003
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Dispase	GIBCO, von Life Technologies	17105-041
35x10 mm Petrischale	Falcon BD	1008
Nr. 5 Dumont Pinzette	Fine Science Tools	11252-20
Schere	Fine Science Tools	14058-11
Federschere	Fine Science Tools	15010-11
Nadelhalter	Fine Science Tools	26016-12
Wolframnadel	Fine Science Tools	26000
Mikrokapillarrohr	Drummond Scientific	3-000-225-G
Pasteur	Pipets Fisher Scientific	13-678-6B
Federschere	Fine Science Tools	15010-11
Klingenhalter	Fine Science Tools	10052-11
Rasierklinge	Fine Science Tools	10050-00