Orthotopen Xenografting of Human Luciferase-Tagged malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen für In vivo Prüfung von Kandidaten Therapeutika

1. Erste Vorbereitung des Non-nude immundefizienten Mäusen (nicht notwendig für Nackt-Stämme):

1. Alle Verfahren wurden überprüft und im Voraus genehmigt von der UAB Institutional Animal Care und Verwenden Committee unter der Leitung von entsprechend geschultem Personal. Wir haben erfolgreich drei Stämme von immundefizienten Mäusen für diese Experimente verwendet: a) Foxchase outbred SCID-Mäusen (CB17/lcr- Prkdc ^scid / lcrCrl Mäuse), b) NIH III-Mäuse (NIHS-Lyst ^bg Foxn1 ^nu Brk ^xid-Mäuse), und c ) NOD-Mäusen SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc ^scid IL2RG ^tm1Wjl / SzJ Mäuse). In unsere Hände ist das Wachstum der orthotopen Xenotransplantate nahezu identisch in NIH III und NOD-Mäusen SCIDγ, die beide Mutationen die Funktion der T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen führen, für dieses Protokoll, die Anzahl der Tage für die Transplantat benötigt Wachstum, sind der Zeitpunkt der Therapie eingeleitet und die Zeiten nach der Transplantation bei der Abbildung wird durchgeführt, die wir empirisch ermittelt haben mit NOD-Mäusen SCIDγ. Graft Wachstum in Foxchase outbred SCID-Mäusen, die Mängel in T-und B-Zell-Funktion haben, in der Regel länger dauert.
2. Zur Erleichterung der Transplantation einer großen Zahl von non-nude immundefizienten Mäusen, entfernen wir Haare von der Operationsstelle am Nachmittag vor der Transplantation. Mäuse sind betäubt mit einer Isofluran-Induktion Kammer an einem Verdampfer mit Aufräumen für das Abgas. Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur werden die Tiere auf einem Heizkissen während dieses Prozesses behandelt werden. Clippers werden verwendet, um Haare aus der Mitte wieder auf das Knie des hinteren Beins auf der Seite, die veredelt werden soll, zu entfernen. Ein verbleibender Haar ist sorgfältig von der Website in ca. 5 Minuten unter Verwendung eines chemischen Enthaarungsmittel (zB Nair, insbesondere ein Produkt mit Aloe Vera für empfindliche Haut) entfernt. Die Entfernung der Enthaarungscreme Produkt ist zu empfehlen, da es zu Reizungen der Haut, Augen und anderen Körperoberflächen, auf die sie verbreiten könnte führen kann. Wir wissen nicht Transplantat sowohl Ischiasnerven in diesen Experimenten, da dies bilateral beeinträchtigen Hinterbein-Funktion, die den Verlust von Mäusen aus den Arbeitskreisen.
3. Mäuse sind erlaubt, sich voll auf ein Heizkissen in einer isolierten Käfig ohne Einstreu erholen, dies sowohl sicher, dass die Mäuse nicht durch andere, völlig wach Tiere verletzt und verhindert, dass sie versehentlich inhaliert Betten. Wenn Mäuse vollständig mobil sind und zeigen keine Anzeichen von Abgeschlagenheit, können sie in einen Käfig mit anderen Mäusen wieder eingeführt werden.

2. Vorbereitung der MPNST Cells for Injection am Tag der Transplantation

1. In diesem Protokoll, auch veredelt die spezifischen Anzahlen von Zellen und die Zeiten für das Tumorwachstum notwendigen Post-Transplantation sind die, die wir empirisch für ST88-14-Zellen, eine häufig verwendete MPNST Linie, die von einem NF1-assoziierten Tumor ⁵ abgeleitet wurde festgestellt haben. Die Zellen verwenden wir für die Transplantation wurden mit einem lentiviralen Vektor mit einem CMV-Luciferase-IRES-Puromycin-Kassette und Klone stabil exprimieren Glühwürmchenluciferase durch Biolumineszenz-Bildgebung ⁶ identifiziert worden transduziert. Wir haben auch durchgeführt Pfropfen Experimente mit MPNST Zellen, die stabil mit Plasmiden Ausdruck Glühwürmchenluciferase unter der Kontrolle des CMV immediate early-Promotor transfiziert. Wir empfehlen nicht, diese, wie wir festgestellt, dass diese Plasmid-Vektoren anfällig für Aussterben der folgende Ausdruck Transplantation unterziehen müssen.
2. ST88-14-Zellen sind in minimal essential Dulbecco-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 10 ug / ml Streptomycin und 10 IU / mL Penicillin (DMEM10) ergänzt gewachsen, 5 ug / ml Puromycin ist ebenfalls enthalten, um die Auswahl für den lentiviralen Vektor zu erhalten. Wir haben diese Zellen in unserem Labor erhalten für 50 Passagen und haben keine Variation in das Zellwachstum in jeder dieser Passagen beobachtet. 9 x 10 ⁵ ST88-14-Zellen sind in einem T175 Kolben verzinkt und aufgewachsen für 3 Tage, an welchem ​​Punkt der Kolben etwa 80% konfluent ist. Um Transplantat 35 Mäuse, ist eine einzige 80% konfluenten T175 Kolben erforderlich; bei dieser Dichte ist unser Durchschnittsertrag für ST88-14-Zellen 7,3 x 10 ⁶ Zellen pro T175 Kolben. Es ist sehr wichtig, dass die Zellen nicht erlaubt, bis zur Konfluenz vor wachsen, um für die Veredelung der Ernte werden. Wir haben festgestellt, dass Pfropfen Zellen aus konfluenten Flaschen ergibt sich ein höheres Maß an Transplantatversagen geerntet und oft verlängert die in vivo Laufe des Transplantats Wachstum.
3. ST88-14 Zellen werden einmal mit balanced salt Raumtemperatur Hanks 'Lösung gespült. Die Zellen werden aus der Flasche mit der Zell-Zell-Dissoziation Stripper-Lösung für 30 Sekunden bis 1 Minute bei Raumtemperatur entfernt. Fünf Milliliter DMEM10 (Hinweis: Puromycin ist in diesem Medium nicht im Lieferumfang enthalten) pro Milliliter of Cell Stripper verwendet werden dann zu den Zellen gegeben.
4. Die Zellen werden gezählt unter Verwendung einer Zählkammer. 5 x 10 ³ ST88-14-Zellen in 3 ul ausgesetzt werden pro Maus injiziert werden. Eine Menge von Zellen ausreichen, um Transplantat die gesamte Kohorte mit Zulage für das PipettierenFehler (zB für 35 Mäuse, wir in der Regel übertragen eine Reihe von Zellen ausreichen, um Transplantat 40 Mäuse), ist in ein steriles 1,5 ml Röhrchen überführt. Die Zellen werden bei 3000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgenommen und das Zellpellet resuspendiert in DMEM10 (Hinweis: Puromycin ist in diesem Medium nicht im Lieferumfang enthalten) zu einer Endkonzentration von 5 x 10 ³ Zellen pro 3 ul. Halten Sie die Zellen auf Eis.

3. Grafting Protocol

1. Mäuse sind betäubt in der Induktion Kammer eines Isofluran Verdampfer, bis sie zurücktreten nicht mehr ihren Hinterlauf eine Zehe Prise Reiz. Mäuse sind auf ihrer Seite platziert und subkutan mit 0,05 mg / kg von Buprenorphin hydrocholoride injiziert. Anästhesie wird dann über die kontinuierliche Verabreichung von Isofluran via Nasenkonus geliefert erhalten. Bitte beachten Sie, dass ein eingeschläfert Mäusen verwendet wurde, um diesen Vorgang für das Video zeigen, folglich ist die Isofluran-Schläuche verwendet werden, um zu liefern Isofluran nicht sichtbar in dem Video.
2. Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur werden die Tiere auf einem Heizkissen in der Pfropfen Prozess behandelt. Um zu verhindern, Hornhaut Austrocknung, einen kleinen Tropfen Augensalbe (Puralube Veterinär-Salbe) ist für jedes Auge verabreicht. Da es notwendig sein wird für jede Maus einzigartig in der gesamten Studie identifiziert werden, ist eine Ohrmarke mit einer eindeutigen Kennung klickt, um den rechten Ohr jeder Maus abgeschnitten.
3. Legen Tier auf den Magen, Verbreitung Hinterbeine. Decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch, Freilegung der chirurgischen Fenster (Flanke), wo auftreten Pfropfen. Die sterilen Tuch sollte die Visualisierung des Kopfes, sowohl um sicherzustellen, dass die Nase immer noch innerhalb des Kegels und die Überwachung der Atmung und das Tier die Farbe zu ermöglichen. Bewerben betadine die Operationsstelle mit einem Wattestäbchen, beginnend in der Mitte der Flanke und allmählich spiralförmig nach außen, um die Kanten des chirurgischen Fenster. 70% Ethanol wird dann auf den OP-Gebiet in der gleichen Weise angewendet. Fortlaufende Anwendungen betadine mit Ethanol sind noch zweimal wiederholt.
4. Entfernen Zellen aus Eis und entweder vorsichtig vortexen oder Springmesser, das Rohr ständiger Zellen zu resuspendieren. Mit einer Pipette entfernen 3,2 ul der Zellsuspension und werfen sie auf ein Stück Parafilm. Durch das Entfernen von mehr als nötig und Platzierung der Suspension auf Parafilm, können wir sicherstellen, dass keine Luftblasen in der Suspension und dass wir eine volle 3 ul für die Injektion. Ziehen Sie so viel von der Zellsuspension möglich in einen 10 l Hamilton-Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel ausgestattet. Flick Blasen aus der Spritze und vertreiben die überschüssige Zellsuspension genau 3 ul. Halten Sie die Zellen und die Zellen enthaltende Spritze auf Eis bis zum Gebrauch; um sicherzustellen, dass die Nadel steril bleibt, darf nicht in Kontakt mit dem Eis oder den Eimer. Ein Stück Frischhaltefolie auf dem Eis, die Spritze aus direktem Kontakt mit dem Eis gelegt werden.
5. Mit einem Skalpell Nr. 4 Griff mit einem Nr. 22 Skalpell ausgestattet, um einen Schnitt durch die Haut von der Flanke direkt unterhalb und parallel zum Femur, stellen Sie sicher, dass der Schnitt nicht über die Grenzen des chirurgisch abgetrennt Bereich zu erweitern. Öffnen Sie den Hautschnitt mit einer chirurgischen Klemme oder manuell auf den darunterliegenden Muskeln freizulegen. Ein Faszienebene sichtbar sein wird, die entlang der Länge des Beines, der Ischiasnerv liegt unterhalb dieser und zwischen den beiden Muskeln durch die Faszie verbunden. Mit einem Paar scharfer Spitze Schere, stumpf durch diese Faszie sezieren, um den Ischiasnerv, der offensichtlich sein sollte als eine weiße lineare Struktur über die Dicke eines dicken Faden aussetzen.
6. Mit einem Paar scharfer Spitze gebogenen Pinzette vorsichtig unter die Nerven zu sezieren, lockert es von der darunter liegenden Muskeln, das sowohl erhebt und isoliert die Nerven. Verlassen Sie die Zange unter die Nerven, diese Position zu halten. Schieben Sie die Nadel des Hamilton-Spritze in den Nerv, versucht, den Winkel der Injektion als parallel mit den Nerven wie möglich zu halten, so dass die Nadel nicht Punktion durch die Unterseite des Nervs. Die Nadel sollte gegen Ende des Nervs distal eingefügt werden soll die Wirbelsäule, wir haben festgestellt, dass die Injektion von Tumorzellen in die Nervenzellen in Richtung des Rückenmarks die gepfropften Tumorzellen stellt in größerer Nähe zum Rückenmark. Wenn dies geschieht, die Tumorzellen oft dringen in das Rückenmark, was zu einer vorzeitigen Verlust des Tieres, von der Arbeitsgruppe wegen des Rückenmarks Funktion beeinträchtigen.
7. Sobald die Nadel richtig in den Nerv positioniert, entspannen sich die Spannung in den Nervenzellen durch die Zange produziert und langsam injizieren Zellen aus der Spritze in den Nerv über 45-60 Sekunden. Es ist wichtig, dass diese langsam erfolgen so schnell Vertreibung der Spritze Inhalte in einem "Back-wash" von Tumorzellen an der Injektionsstelle und deren Verlust führen wird. Nachdem alle Zellen erfolgreich gespritzt haben, langsam ziehen Sie die Nadel, um den Verlust des injizierten Materials zu minimieren.
8. Entfernen Sie die fürSteinpilze und vorsichtig Nerven wieder in seine ursprüngliche Position unter dem Muskel. Schließen Sie die Operationswunde mit Vetbond chirurgische Kleber. Halten Schnitt zusammen mit einer Pinzette für etwa 20 Sekunden, bis der Leim trocken.
9. Die Maus ist aus der Isofluran Nasenkonus entfernt und allein in einem Bett-free-Käfig zu erholen. Dieser Käfig sollte auf der Spitze eines Heizkissen gehalten werden, bis das Tier vollständig erholt hat. Ein Teil der Erholung Käfig sollte nicht auf einem Heizkissen werden, ermöglicht dies dem Tier weg von der Hitze, wenn sie zu warm wird. Nach Transplantation, sollten die Tiere regelmäßig zum Kauen an der Stelle, Lahmheit oder Magersucht beurteilt werden; diese Zeichen könnten darauf hinweisen, das Tier ist noch immer Schmerzen und das richtige Schmerzmittel gegeben werden sollte. Nach Erfahrungen mit diesem Verfahren haben wir festgestellt, dass 30-40 Mäusen ohne weiteres an einem einzigen Tag gepfropft werden.

4. Beurteilung der Graft Erfolg und Randomisierung in Studiengruppen

1. Biolumineszenz-Bildgebung wird verwendet, um den Erfolg der Transplantation Verfahren zu beurteilen. Wir verwenden ein IVIS-100-System (ursprünglich aus Xenogen, die jetzt als Messschieber Inc. bekannt ist), um die Lichtemission von Tumor-Ausdruck Glühwürmchenluciferase, die als Ergebnis der chemischen Reaktion von Luciferase mit ihrem Substrat, D-Luciferin entsteht erkennen . Die Analyse dieser Bilder entscheiden, ob bestimmte veredelt Mäuse geeignet für den Einstieg in den therapeutischen Prozess Kohorten. In Vorversuchen haben wir die Biolumineszenz-Signale nachweisbar, geopfert veredelt Mäusen geerntet ihre Tumoren und korreliert Tumorgewichte mit dem Biolumineszenz-Signale von region of interest Analysen des Herstellers Living Image Software quantifiziert. Diese Studien zeigten, dass es eine lineare Korrelation zwischen Tumor-Transplantat Gewichte und Biolumineszenz Lichtemission, was darauf hinweist, dass Biolumineszenz-Bildgebung ist ein geeigneter Ersatz Mittel zur Beurteilung Xenograft Wachstum im Verlauf der präklinischen Studien. In der Regel haben wir Bild 5 Mäuse gleichzeitig. Zusätzliche Angaben zur Biolumineszenz-Bildgebung wurden bisher ⁷ veröffentlicht.
2. Um zu beurteilen, graft Erfolg wird Biolumineszenz-Bildgebung 1 durchgeführt und 3 Tage nach der Transplantation. Die Bilder werden von Mäusen in die gleiche Position 10 min nach intraperitonealer Injektion von 2,5 mg D-Luciferin gesammelt. Während der Aufnahme werden die Mäuse unter Isofluran-Narkose und ihre Körpertemperatur auf 37 ° C durch ein Heizkissen im Xenogen Imager gehalten gepflegt. Bildaufnahme Zeiten sind im Bereich von 2 sec bis 10 min; der Datenerfassungs-Software stellt sicher, dass keine Pixel während Bildsammlung gesättigt sind. Lichtemission von Tumor-Regionen (relative Photon counts / sec) wird unter Verwendung von proprietärer Software aus Xenogen. Die Lichtemission Intensität wird durch Falschfarbendarstellung Skalierung der Biolumineszenz, die auf Schwarz-Weiß-Fotografien von den Mäusen, die zur gleichen Zeit erhoben werden überlagert dargestellt.
3. Um förderfähig zu sein für die Aufnahme in einer präklinischen Studie Kohorte, müssen Mäuse haben einen nachweisbaren Biolumineszenzsignal beiden 1 und 3 Tage nach der Transplantation und die Intensität der Biolumineszenz-Signal zwischen den Tagen 1 und 3 erhöhen müssen. Tiere, die eine verminderte oder statisches Signal haben, sind ausgeschlossen. Darüber hinaus sollten Signale bei Mäusen noch am selben Tag veredelt erkannt innerhalb von 1 in der Größenordnung von einander; Mäuse mit Biolumineszenz-Signale, die eine Größenordnung niedriger oder höher als die bei Tieren noch am selben Tag veredelt erkannt werden, sind ebenfalls ausgeschlossen.
4. Sobald Mäusen identifiziert worden, die diese Kriterien erfüllen, müssen sie nach dem Zufallsprinzip in Behandlungsgruppen. Um dies zu erreichen, Luciferase-Signale in gepfropft Mäusen nachgewiesen 3 Tage post-Transplantation werden zunächst vom höchsten zum niedrigsten Intensität bestellt. Mäuse werden dann nach dem Zufallsprinzip in Gruppen, indem Sie ihnen in der Reihenfolge der Intensität der Behandlung Gruppen, Umkehr dieses bestellen und dann den Prozess wiederholen, bis alle Mäuse Gruppen zugeordnet sind. Zum Beispiel werden, wenn es 4 Behandlungsgruppen (zB Placebo und drei Konzentrationen von Testsubstanz) Mäusen, die Gruppen in der Reihenfolge 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 zugeordnet , 4, 4, 3, 2, 1 .. etc. Vor Beginn der Behandlung werden die Biolumineszenz-Signale in jedem Mitglied der zugewiesenen Gruppe erkannt gemittelt werden, um sicherzustellen, dass die durchschnittlichen Einstiegsgehälter Signale in allen Gruppen sind so nah wie möglich. Verwaltung des Kandidaten Therapeutikum ist am Tag 3 begonnen.
5. Zur Beurteilung der Wirkung der therapeutischen Wirkstoff hat auf die Graft-Wachstum im Verlauf der Behandlung wird Biolumineszenz-Bildgebung durchgeführt, nachdem eine Woche nach Beginn der Therapie (Tage 10, 17, 24, 30 Post-Transplantation). Für Nicht-nude immundefizienten Mäusen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Tiere wieder neue Fell Wachstum mit Nair vor der Durchführung jedes Imaging-Sitzung entfernt. Dies liegt daran, Haar-Blöcke Biolumineszenz-Signale, mit der Haarfarbe bestimmen, wie viel von dem Signal verloren geht. So ist zum Beispiel weißes Fell wie auf Schweizer W gefundenEbster Mäusen produziert ein 18% ige Reduktion der Biolumineszenz Signalintensität ^8, während schwarzes Fell können Signale so viel wie 10-fach ⁹ zu verringern. Wir würden auch beachten, dass nicht davon ausgegangen werden, dass einheitliche Fell nachwachsen wird in allen Behandlungsgruppen und "normalisieren" Signal Reduktionen zwischen den Behandlungsgruppen auf. Dies liegt daran, das therapeutische Mittel selbst Haarwachstum beeinträchtigen können. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass Tamoxifen-Behandlung das Nachwachsen der Haare verhindert und minimiert dadurch die wahrgenommene Wirkung dieses Mittels auf das Tumorwachstum im Vergleich zu Placebo-behandelten Mäusen verglichen.
6. Mit ST88-14 MPNST Zellen, können Mäuse für 30 Tage post-Transplantation durchgeführt werden. Zu diesem Zeitpunkt Tumoren haben in der Regel auf die maximale Größe von institutionellen Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschüssen erlaubt gewachsen und muss geopfert werden. Nach der letzten Imaging-Sitzung werden die Mäuse getötet und Proben, die für die weitere Analyse der Behandlungsergebnisse (zB Blut zur Bestimmung der Blutspiegel des Therapeutikums, Tumorgewebe zur Gewichtsbestimmung, Untersuchung der Histologie, die Bestimmung von Ki67 und TUNEL Kennzeichnung Indizes und Beurteilung der biochemische Parameter) gesammelt. Genau das, was Proben gesammelt werden, auf die Bedürfnisse der experimentellen Design ab.
7. Mäuse mit Tumoren täglich sollten überwacht werden und beendet werden, wenn sie krank (fehlende normale Pflege und Vermeidungsverhalten) werden, sind nicht in der Lage zu essen oder zu trinken, oder wenn der Tumor wird übermäßig groß ist wie die normale Bewegung des Körpers zu verhindern. Tumorlast darf nicht 10% des Tieres ein normales Körpergewicht überschreiten. Tumor Gewicht als Prozentsatz des Körpergewichts wird durch den Vergleich des Gewichts der tumortragenden Tieren, um das Gewicht von Alter / Geschlecht abgestimmt Kontrolltieren berechnet. Kachexie sollte nicht erlaubt werden, klinisch signifikanten werden. Gewichtsverlust in Tumor-tragenden Tieren sollte nicht mehr als 20% des normalen Körpergewichts.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1 zeigt die typische progressive Zunahme der Biolumineszenz beobachtet 1 bis 18 Tage nach der Transplantation in eine ordnungsgemäß gegründet orthotope Xenograft in einem Akt (NIH III)-Maus (AC). Die Quantifizierung der Biolumineszenz-Signale beobachtet 1-24 Tage nach Transplantation zeigt, dass, obwohl diese Signale weiter zu erhöhen, das Tumorwachstum deutlich beschleunigt in den späteren Phasen des Studiums (Abbildung 1D). Um konsequent zu demonstrieren, dass das Tumorwachstum in Mäusen veredelt aufgetreten, wir erheben routinemäßig den Ischiasnerv und, wenn es scheint, dass Tumor hat das Epineurium gerissen und fielen angrenzende Gewebe, das umgebende Weichgewebe und Skelettmuskel. Angesichts der aggressiven Wachstum der MPNSTs, ist es nicht verwunderlich, dass wir oft feststellen, dass die gepfropften Tumorzellen verletzt haben den normalen Schranken des Nerven-und drangen benachbarte Gewebe (Abb. 1E). Wir haben auch oft feststellen, dass veredelt MPNST Zellen aggressiv wandern in Nerv proximal und distal des Transplantates vor Ort.

Abbildung 1. Biolumineszenz-Bildgebung des NIH III Maus orthotop mit Luciferase-markierte Zellen MPNST gepfropft 1 Tag post-Pfropfen (A). Beachten Sie, dass die Signale innerhalb der Region of Interest (ROI) in verschiedenen Mäusen nachgewiesen sind alle innerhalb einer Größenordnung von einander. Re-imaging 10 Tage (B) und 18 Tage (C) nach Transplantation zeigt, dass Biolumineszenz-Signale zunehmend auf das Transplantat vor Ort in den einzelnen Mäusen zu erhöhen. (D) Diagramm, das die progressive Zunahme der relativen Photonen / Sekunde über das Transplantat vor Ort 1-24 Tage nach der Transplantation festgestellt. (E): Mikroskopische Aufnahme des Transplantats von dieser Maus zeigt das Tumorwachstum und die Schwerpunkte Invasion in benachbarte Skelettmuskulatur.