Orthotopen Xenografting of Human Luciferase-Tagged malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen für In vivo Prüfung von Kandidaten Therapeutika

Ein Verfahren zur sicheren Pfropfen Luciferase-markierten menschlichen malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen in den Ischiasnerv von immundefizienten Mäusen beschrieben. Der Einsatz von Biolumineszenz-Bildgebung, um die ordnungsgemäße Errichtung von Tumor Transplantate und Kriterien für die zufällige Trennung der Tiere in Arbeitsgruppen zeigen, werden ebenfalls diskutiert.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, festzustellen, ob ein Therapeutikumskandidat das Wachstum von M-P-N-S-T-Zellen, die in den Ischiasnerv von immundefizienten Mäusen transplantiert wurden, wirksam hemmt. Dies wird erreicht, indem die Tumorzellen zunächst aus einem Gewebekolben entnommen, gewaschen und in der richtigen Konzentration aufgehängt werden. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, den Ischiasnerv chirurgisch freizulegen und dann dem Nerv 5.000 Zellen zu injizieren.

Der nächste Schritt besteht darin, den Erfolg der Transplantation mit Hilfe einer lichtbasierten In-vivo-Bildgebung zu bestimmen, die CIN an Studiengruppen zu randomisieren und die Therapie mit dem Therapeutikakandidaten zu beginnen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Tumore 30 Tage nach der Transplantation zu sammeln und die Auswirkungen des Therapeutikakandidaten auf den Tumor zu analysieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, ob das Therapeutikum das Tumorwachstum durch Methoden wie den Vergleich von Tumorgewichten, die Betrachtung der relativen Proliferationsraten durch Immunfärbung für KI 67 und die Beurteilung des Grades des Tumorzelltods bei kontrollierten und behandelten Mäusen mit Tunnelassays verringert

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der subkutanen Transplantation besteht darin, dass sie die normale Mikroumgebung modelliert, die das M-P-N-S-T-Wachstum besser modelliert. Die Demonstration dieser Technik wird von Amy Turk, einer Technikerin aus meinem Labor, durchgeführt. Nicht nackte immundefiziente Mäuse werden am Tag vor der Transplantation vorbereitet. Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um die Haare einer betäubten Maus zu rasieren, die auf einem Heizkissen arbeitet, um die Körpertemperatur zu halten.

Verwenden Sie ein chemisches Enthaarungsmittel, um alle verbleibenden Haare zu entfernen. Sobald alle Haare entfernt sind, legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in einem Isolationskäfig ohne Einstreu, bis sie sich vollständig erholt hat. Zentrifugieren Sie die Zellen am Tag der Transplantation fünf Minuten lang bei 3000 U/min.

Entfernen Sie vorsichtig die Schlinge und resuspendieren Sie das Zellpellet in DMEM 10 ohne reines Mycin auf eine Endkonzentration von fünfmal 10 auf die dritte Zellen pro drei Mikroliter. Bewahren Sie die Zellen bis zur Verwendung auf Eis auf. Legen Sie zunächst ein betäubtes Tier auf ein Heizkissen und tragen Sie Augensalbe auf jedes Auge auf.

Befestigen Sie eine Ohrmarke mit einer eindeutigen Identifikationsnummer an das rechte Ohr jeder Maus. Um die Identifizierung während der gesamten Studie zu erleichtern, legen Sie das Tier auf den Bauch und spreizen Sie die Hinterbeine. Decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch ab und legen Sie ein chirurgisches Fenster frei, an dem die Transplantation stattfinden wird.

Tragen Sie Betadin mit einem Applikator mit Baumwollspitze auf die Operationsstelle auf, beginnend in der Mitte der Flanke und allmählich spiralförmig nach außen zu den Rändern des Operationsfensters. 70%iges Ethanol wird dann auf die gleiche Weise auf die Operationsstelle aufgetragen. Aufeinanderfolgende Anwendungen von Betadin gefolgt von Ethanol werden noch zweimal wiederholt.

Entfernen Sie die Zellen aus dem Eis und drehen Sie den Schlauch entweder vorsichtig oder schnippen Sie mit dem Schlauch, um die abgesetzten Zellen wieder zu suspendieren. Verwenden Sie eine Pipette, um 3,2 Mikroliter der Zellsuspension zu entfernen und sie auf ein Stück Paraform auszustoßen. Ziehen Sie drei Mikroliter der Zellsuspension in eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze.

Ausgestattet mit einer 33-Gauge-Nadel. Halten Sie die Zellen und die Spritze mit der Zelle bis zur Verwendung auf Eis. Verwenden Sie einen Skalpellgriff mit der Nummer vier, der mit einer Skalpellklinge Nummer 22 ausgestattet ist, um einen Schnitt durch die Haut der Flanke direkt unter und parallel zum Oberschenkelknochen zu machen.

Öffnen Sie den Hautschnitt mit der chirurgischen Klemme, um den darunter liegenden Muskel freizulegen. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um die Faszie, die entlang der Länge des Beins verläuft, abzustumpfen und den Ischiasnerv freizulegen, der unter einer weißen, linearen Struktur von der Dicke eines dicken Fadens unter einem Mikroskop arbeitet. Verwenden Sie eine scharfe, gebogene Pinzette, um vorsichtig unter dem Nerv zu sezieren und ihn vom darunter liegenden Muskel zu lösen.

Lassen Sie die Pinzette an Ort und Stelle, um den Nerv sowohl angehoben als auch isoliert zu halten. Führen Sie die Nadel der Hamilton-Spritze in den Nerv ein und versuchen Sie, den Injektionswinkel so parallel wie möglich zum Nerv zu halten, um nicht bis zur Unterseite durchzustechen. Sobald die Nadel richtig im Nerv positioniert ist, lockern Sie die von der Pinzette erzeugte Spannung und injizieren Sie die Zellen langsam über einen Zeitraum von 45 bis 60 Sekunden. Eine langsame Injektion ist unerlässlich, um eine Rückspülung der Tumorzellen zu verhindern, die zu deren Verlust führt.

Nachdem alle Zellen erfolgreich injiziert wurden, ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um den Verlust des injizierten Materials zu minimieren. Entfernen Sie nach Abschluss der Injektion die chirurgische Klemme und die Pinzette. Platzieren Sie dann den Nerv vorsichtig wieder an seiner ursprünglichen Position.

Schließen Sie den Schnitt mit Vet Bond chirurgischem Kleber und halten Sie ihn mit einer Pinzette etwa 20 Sekunden lang zusammen, damit der Kleber trocknen kann. Setzen Sie das Tier in einen beheizten Käfig ohne Einstreu, bis es vollständig genesen ist. Überwachen Sie die Gesundheit der Mäuse.

Täglich werden Mäuse aus der Studie entfernt. Wenn die Tumorlast 10 % des normalen Körpergewichts des Tieres übersteigt oder der Gewichtsverlust 20 % übersteigtUm den Erfolg des Eingriffs zu bestimmen, führen Sie ein bis drei Tage nach der Transplantation eine Biolumineszenzbildgebung durch. Injizieren Sie einer Maus 2,5 Milligramm Luzifer und legen Sie das anästhesierte Tier auf die beheizte Bildgebungsplattform.

Die Lichtemission von tumorexprimierter Glühwürmchen-Luziferase wird 10 Minuten nach der Injektion des Substrats nachgewiesen. Mit der Software von Xeno Gen können Sie die Bildaufnahmezeiten auf einen Bereich von einer Sekunde bis 10 Minuten einstellen. Machen Sie als Nächstes Schwarz-Weiß-Fotos von den Mäusen Pseudocolor.

Die Skalierung der Biolumineszenz wird mit diesen Bildern überlagert, um ein Maß für die Lichtemissionsintensität zu liefern. Um in eine präklinische Studienkohorte aufgenommen werden zu können, müssen Mäuse sowohl einen als auch drei Tage nach der Transplantation ein nachweisbares Biolumineszenzsignal aufweisen, und die Intensität des Signals muss zwischen dem ersten und dritten Tag zunehmen. Hier ist ein typischer progressiver Anstieg der Biolumineszenz zu sehen, der ein bis 18 Tage nach der Transplantation in einem korrekt etablierten orthotopen Xenotransplantat bei einer Nacktmaus beobachtet wurde.

Beachten Sie die Ähnlichkeit der Signale, die innerhalb des interessierenden Bereichs verschiedener Mäuse detektiert wurden. Eine erneute Bildgebung 10 Tage und 18 Tage nach der Transplantation zeigt, dass die biolumineszierenden Signale an der Transplantatstelle bei einzelnen Mäusen progressiv zunehmen. Die Quantifizierung der Biolumineszenzsignale, die ein bis 24 Tage nach der Transplantation beobachtet wurden, zeigt, dass diese Signale zwar progressiv zunehmen, das Tumorwachstum jedoch in den späteren Stadien des Studienzeitraums deutlich beschleunigt wird.

Aufgrund des aggressiven Wachstums von M pns ts durchbrechen die transplantierten Tumorzellen häufig die normalen Barrieren des Nervs und dringen in benachbarte Gewebe ein. Diese mikroskopische Aufnahme der Transplantatstelle zeigt das Tumorwachstum und die fokale Invasion in den angrenzenden Skelettmuskel. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei richtiger Ausführung an einer Maus in 10 Minuten durchgeführt werden.