Effiziente Polyethylenglykol (PEG) vermittelten Transformation von der Moss Physcomitrella patens</em

Zusammenfassung

Eine einfache und effiziente Methode zur Umwandlung Physcomitrella pantens Protoplasten beschrieben. Diese Methode wird von Protokollen für angepasste Physocmitrella Protonema Protoplasten und Arabidopsis Mesophyll Protoplasten-Transformation ¹.

Protokoll

1. Making the Protoplasten

1. Add 9 ml 8% Mannitol in eine Petrischale.
2. Mit einem Spatel, legte 7 Tage alt Moos 2 bis 3 PPNH4 Platten von 5 - in der Petrischale mit Mannitol.
3. 3 ml 2% Driselase (Sigma D9515-25G) auf der Petrischale.
4. Inkubieren Sie die Petrischale bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 1 Stunde.
5. Filter der Protoplastensuspension durch ein 100 um Sieb (BD Falcon 352350).
6. Drehen Sie das gefilterte Suspension bei 250 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand.
7. Re-suspend die Protoplasten sehr sanft mit 500 ul 8% Mannitol.
8. Fügen Sie 9,5 ml 8% Mannitol in die Kultur Röhre. Stellen Sie sicher, Protoplasten vollständig ausgesetzt.
9. Wiederholen Sie die Filtration und Resuspension Schritten (1,6, 1,7 und 1,8) zwei weitere Male.
10. Nehmen Sie sich 10 ul der Protoplasten-Lösung und zählen die Protoplasten in einer Zählkammer.
11. Multiplizieren Sie die Anzahl der Protoplasten in einem 16 Quadratmeter Fläche um 10.000, die Zahl der Protoplasten pro ml zu erhalten (siehe Abbildung 1).

2. Transformation

1. Spin der Protoplastensuspension bei 250 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand.
2. Re-suspend Protoplasten in der MMG-Lösung bei einer Konzentration von 1,6 Millionen Protoplasten / ml.
3. Inkubieren Sie die Protoplastensuspension bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
4. Add 600 ul der Protoplastensuspension in eine Kultur Röhrchen mit 60 ug DNA. Swirl das Rohr vorsichtig.
5. Add 700 ul PEG / Ca-Lösung in die Protoplasten / DNA-Mischung. Swirl das Rohr vorsichtig, bis das gesamte Mischung homogen ist.
6. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
7. Während dieser Wartezeit, decken PRM-B-Platten mit Zellophan (80 mm Durchmesser Kreise, AA Packaging Limited, UK); ermöglichen Zellophan zu Hydrat auf der Plattenoberfläche für mindestens 5 min.
8. Mit einem Spatel, entfernen Sie alle Luftblasen zwischen dem Cellophan und der Platte.
9. Verdünnen Sie die Mischung mit 3 ml W5-Lösung.
10. Drehen Sie das Gemisch bei 250 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand.
11. Re-suspend Protoplasten in geschmolzenem 2 mL der PRM-T (vor der Zugabe zu den Protoplasten dieser Lösung flüssig gehalten bei 42 ° C sein kann). Plate 1 ml resuspendieren Protoplasten pro PRM-B Platte durch Cellophan abgedeckt. Wickeln Sie die Platten mit Micropore (3M, Health Care). Halten Sie die Platten bei 25 ° C in einer Klimakammer.
12. Alternativ können Protoplasten in 1 ml Flüssigkeit plating mittel-und vernickelt 0,5 ml auf einem PRM-B-Platte mit Cellophan abgedeckt resuspendiert werden. Dies ermöglicht eine schnellere Regeneration, aber die Zahl der Regeneration von Pflanzen ist geringer.
13. Growth Kammer ist für einen 16 h eingestellt. Licht und 8 Stunden. Dunkel-Zyklus.
14. Bewegen Sie das Zellophan auf eine frische Auswahl Platte 4 Tage nach der Transformation.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Ein Beispiel der Transformation ist in Abbildung 2 dargestellt. Die DNA in diesem Beispiel wurde ein supercoiled 7,8 kb Plasmid, ein Hygromycin resistent Kassette. Die Höhe der Protoplasten vergoldet wurde auf 50% für die Fotografie reduziert. Die Bilder wurden zwei Wochen nach dem Pflanzen, um die Auswahl Platten wurden verlegt. Die Transformationseffizienz wird nicht durch die DNA-Konzentration von bis zu 60 ug betroffen. Höhere Konzentrationen von DNA wirken sich nachteilig auf die Effizienz der Transformation. Die Daten zeigten, dass diese Methode konsistentes Ergebnis über einen weiten Bereich von DNA-Mengen liefert. Diese Methode kann auch zu generieren stabile Transformanten effektiv wie in Tabelle 1 dargestellt, können wir über 4 stabile Transformanten pro Mikrogramm linearisierte DNA, die viel höher sind als das, was bisher ¹⁴ gemeldet wird erhalten.

Wir testeten auch die Wirkung von Hitzeschock auf die Transformationseffizienz durch Umwandlung eines supercoiled Plasmid ein Gen für ein fluoreszierendes Protein als Marker. Der Hitzeschock erfolgte 10 Minuten nach Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt (im Schritt 2,6) durch Inkubation der Mischung in einem 45 ° C Wasserbad für 3 Minuten. Die Mischung wurde in einer Raumtemperatur Wasserbad unmittelbar nach Hitzeschock für 17 min inkubiert. Die Ergebnisse wurden 22 Stunden nach der Transformation aufgenommen. Die Verhältnisse der erhaltenen Transformanten mit und ohne Hitzeschock sehr ähnlich waren (~ 25%), aber wir beobachten einen negativen Effekt von Hitzeschock auf die Lebensfähigkeit der Protoplasten (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 1. Blick auf Protoplasten in Hämozytometer. Der Abschnitt für Protoplasten Zählen gebraucht wird durch ein rotes Quadrat angezeigt. Beachten Sie die 16 Quadrate zu zählen Protoplasten (vgl. 1,11) erforderlich, das Bild zeigt eine Anzahl von 24 Protoplasten (240.000 Zellen / ml).

Abbildung 2. Bilder von 18 Tage alten transiente Transformanten. Protoplasten wurden transgebildet mit der angegebenen Menge supercoiled Plasmid. A: 15μg; B: 30 &mgr; g; C: 60μg; D: 120μg.

DNA-Menge (pg)	Efficiency (Transformanten / ug DNA)
15, supercoiled Plasmid	120 ± 24
30, supercoiled Plasmid	145 ± 54
60, supercoiled Plasmid	121 ± 60
120, supercoiled Plasmid	71 ± 38
60, linearisierte Plasmid	4 ± 1

Tabelle 1. Transformation Effizienz auf verschiedenen DNA-Mengen.

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine einfache und konsistente DNA-Transformation in Physcomitrella patens Protoplasten. Diese Methode wurde ursprünglich für Arabidopsis ¹ entwickelt, aber hier haben wir gezeigt, dass es gut funktioniert mit Protoplasten von Physcomitrella patens, eine einfachere und verschiedene Pflanzenarten. Daher kann diese Methode auf andere Pflanzenarten mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Mögliche Modifikationen zur Optimierung gehören Protoplastenkonzentration in der MMG, Inkubationszeit in MMG und PEG / Ca-Lösung. Wir entscheiden uns für 60 ug DNA in unseren Routineversuche zu verwenden, da die Zahl der Transformanten steigt linear mit der DNA-Konzentration bis zu diesem Zeitpunkt (Tabelle 1). Wir konnten etwa 7000 transiente Transformanten oder 200 stabile Transformanten auf einer einzigen 60 ug DNA-Transformation, die zur weiteren Überprüfung und Analyse einer großen Population von Pflanzen ermöglicht.

Die transformierten Protoplasten können entweder verteilt mit Flüssigkeit plating Medium oder PRM-T werden. Obwohl die Regeneration Wirkungsgrad ist niedriger, wenn flüssige Beschichtung Medium verwendet wird, wählen wir diese Methode, wenn die Protoplasten mit supercoiled Plasmiden transformiert wurden. Da zeigten die in Tabelle 1, erzeugen Transformationen mit supercoiled Plasmid-DNA erfolgt viel mehr Transformanten und somit können wir immer noch erhalten eine große Anzahl von Anlagen mit flüssigen Beschichtung Medium. Darüber hinaus verbreiten Protoplasten mit flüssigen Beschichtung Medium ermöglicht eine schnellere Regeneration, was wichtig ist für Experimente, die transiente Phänotypen, wie RNAi knock down Experimenten ^9,15. Neben dem Fehlen von Top-Agar ermöglicht eine einfache Anlage Trennung für Immunfärbung und RT-PCR ^9,15.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Zutat
PPNH 4	1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 mM Diammonium Tartrat 54 um FeSO 4 .7 H 2 O 9,93 uM H 3 BO 3 1,97 pM MnCl 2 .4 H 2 O 0,23 um CoCl 2 .6 H 2 O 0,19 pM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 &mgr; M CuSO 4. 5H 2 O 0,10 um Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0,168 uM KI Add 0,7% Agar für festes Medium.
PRM-B	PPNH 4 mit 6% Mannitol und 0,8% Agar. Fügen Sie 10 ml 1M CaCl 2 bis 1 L vor dem Gießen-Platten.
PRM-T	PPNH 4 mit 6% Mannitol und 0,6% Agar. Fügen Sie 0,5 ml 1M CaCl 2 bis 50 mL vor dem Gebrauch.
Flüssige Mittel Plating	PPNH 4 mit 8,5% Mannit ohne Agar. Fügen Sie 0,5 ml 1M CaCl 2 bis 50 mL vor dem Gebrauch.
2% Driselase	4 g Driselase (Sigma D9515-25G) auf 200 ml 8% Mannitol. Leicht umrühren für 30 min. bei Raumtemperatur inkubieren 30 min. bei 4 ° C, und sanft rühren 5 min. bei Raumtemperatur. Spin 2.500 g für 10 min, verwerfen Pellet. Filter mit 0,22 um, und speichern Sie bis zu 10 mL Aliquots eingefroren. Tauwetter in einer Raumtemperatur Wasserbad vor dem Gebrauch.
MMG	0,4 M Mannitol 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5,7)
PEG / Ca	4 g PEG4000 3 mL H 2 O 2,5 ml 0,8 M Mannit 1 mL 1 M CaCl 2
W5	154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7)