NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Zusammenfassung

Die Verwendung von NanoDrop Mikrovolumens Systeme als praktische und effiziente Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methodik ist durch die Demonstration von zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokollen beschrieben.

Zusammenfassung

Biomolekulare Analysen werden kontinuierlich weiterentwickelt, dass die Verwendung immer kleiner Mengen von Material, oft entgegensteht, die Verwendung von konventionellen Küvette Instrumente für Nukleinsäure-Quantifizierung für diejenigen, die Mikrovolumens Quantifizierung durchführen können.

Die NanoDrop Mikrovolumens Probenretention System (Thermo Scientific NanoDrop Products)-Funktionen durch die Kombination von LWL-Technik und natürliche Oberflächenspannung Eigenschaften zu erfassen und zu behalten winzige Mengen der Probe unabhängig von traditionellen Containment Geräte wie Küvetten oder Kapillaren. Darüber hinaus verwendet das System kürzere Weglängen, die sich in einer breiten Palette von Nukleinsäure-Konzentration Messungen im Wesentlichen entfällt die Notwendigkeit, Verdünnungen durchzuführen. Verringerung des Volumens der Probe für die spektroskopische Analyse erforderlich erleichtert auch die Aufnahme von zusätzlichen Qualitätskontrolle Schritten über viele molekulare Abläufe, Steigerung der Effizienz und letztlich zu mehr Vertrauen in nachgelagerten Ergebnisse.

Die Notwendigkeit hoher Empfindlichkeit fluoreszierender Analyse der begrenzten Masse hat auch mit den jüngsten experimentellen Fortschritte hervor. Mit der gleichen Mikrovolumens Probenretention Technologie kann Fluoreszenz-Messungen mit 2 ul des Materials durchgeführt werden, so dass Fluoreszenzassays Volumen Anforderungen deutlich reduziert werden. Solche Mikroreaktionen von 10 ul oder weniger sind jetzt möglich mit einem dedizierten Mikrovolumens fluorospectrometer.

Zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokolle zeigten, dass die Verwendung integrierter Probe Rückhaltesysteme als praktische Alternative zu herkömmlichen Küvetten-basierte Protokolle werden. Zunächst wird eine direkte A260 Absorption unter Verwendung eines Mikrovolumens Spektralphotometer beschrieben. Dies wird durch eine Demonstration eines Fluoreszenz-basierten Verfahren, das mit reduziertem Volumen Fluoreszenz Reaktionen ermöglicht mit einem Mikrovolumens fluorospectrometer gefolgt. Diese neuen Techniken ermöglichen die Beurteilung von Nukleinsäure-Konzentrationen von 1 pg / ul bis 15.000 ng / ul mit minimalem Verbrauch der Probe.

Protokoll

1. Mikrovolumen Nucleic Acid Quantifizierung Mit einem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

1. Um zu beginnen, reinigen Sie den oberen und unteren optischen Oberflächen der Mikrovolumens Spektralphotometer Probe Rückhaltesystem durch Pipettieren von 2 bis 3 ul von sauberem VE-Wasser auf die untere optische Oberfläche.
2. Schließen Sie den Hebelarm, sicherzustellen, dass die obere Podest in Kontakt mit dem VE-Wasser kommt. Heben Sie den Hebelarm und wischen Sie die beiden optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor.
3. Öffnen Sie die NanoDrop Software und wählen Sie die Nukleinsäure-Anwendung. Verwenden Sie einen kleinvolumigen, kalibrierte Pipette, um eine leere Messung durch den Verzicht auf 1 ul des Puffers auf die untere optische Oberfläche durchzuführen. Senken Sie den Hebel, und wählen Sie "Blank" in der Nukleinsäure-Anwendung.
4. Sobald die Blank-Messung abgeschlossen ist, reinigen Sie beide optischen Oberflächen mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor.
5. Wählen Sie die entsprechende Konstante für die Probe, die gemessen werden soll.
   

   Sample Type	Wählen Sie die Option	Konstante, mit der Konzentration berechnen
   dsDNA	DNA-50	50
   ssDNA	DNA-33	33
   RNA	RNA-40	40
   Oligo	Brauch	15-150

   Tabelle 1. Typische Nukleinsäure Konzentrationsbereiche für direkte A280 Absorptionsmessungen mit einem NanoDrop Mikrovolumens Spektralphotometer, einem traditionellen Küvette-based-Spektralphotometer mit einem TrayCell Mikrozelle Küvette verwendet, und ein Mikrovolumens NanoDrop fluorospectrometer in Verbindung mit dem PicoGreen Assay.
6. Dispense 1 ul der Nukleinsäure-Probe auf die geringere optische Sockel und schließen Sie den Hebelarm. Da die Messung Volumen unabhängig, die Probe muss nur die Kluft zwischen den beiden optischen Oberflächen für eine Messung vorgenommen werden überbrücken.
7. Wählen Sie "Messen" in der Anwendungssoftware. Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Leistung.
8. Die Software berechnet automatisch die Nukleinsäure-Konzentration und Reinheit Verhältnisse. Nach Probenmessung, überprüfen Sie die spektrale Bild auf Probe Qualität zu beurteilen.
9. Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil.
   
   Abbildung 1. Ein typisches Nukleinsäureprobe haben ein sehr charakteristisches Profil.
10. Häufige Quellen von Verunreinigungen mit spezifischen Nukleinsäure-Isolierung-Verfahren sind die Phenol / Trizol und Spalte Extraktion. Im Falle von Phenol / Trizol-Extraktion, können Rest-Reagenz Kontamination durch abnorme Spektren zwischen 220 bis 240 nm sowie durch Verschiebungen in der 260-280 nm-Bereich angegeben werden. Umgekehrt kann Rest-Guanidin aus Spalte Extraktion auf einen Spitzenwert in der Nähe 230 nm und eine Verschiebung in den Trog von 230 nm bis etwa 240 nm beitragen.
    
    Abbildung 2. Die Verschiebungen in den Höhen und Tiefen der Proben B und C im Vergleich zu Probe A zeigen, wie Verunreinigungen können die Spektren von Nukleinsäure-Proben beeinflussen.
11. Um genau zu beurteilen Probe Qualität, sollte 260/280 oder 260/230 Verhältnisse in Verbindung mit der tonalen Qualität analysiert werden. Reine Nukleinsäuren typischerweise ergeben eine 260/280 Ratio von etwa 1,8 und einem 260/280 Ratio von ~ 2,0 für DNA und RNA, bzw.. Dieses Verhältnis ist abhängig vom pH-Wert und Ionenstärke des Puffers verwendet, um den Leerwert und Probe-Messungen zu machen. Saure Lösungen werden unter-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3, während einer basischen Lösung wird über-stellen das Verhältnis um 0,2-0,3. Signifikant verschieden Reinheit Verhältnisse können auf das Vorhandensein von Protein-, Phenol-oder andere Verunreinigungen, die stark absorbieren bei oder nahe bei 280 nm. Die 260/230 Reinheit Verhältnis ist eine zweite Maßnahme der DNA-Reinheit mit den Werten für eine "reine" Nukleinsäure üblicherweise im Bereich von 1,8-2,2. Purity-Verhältnisse, die deutlich niedriger als die erwarteten Werte sind möglicherweise für die Isolierung verwendete Technik kann weiter optimiert werden müssen.
12. NanoDrop Spektralphotometer kann auch verwendet werden, um Proteine ​​durch direkte Absorption oder durch Protein kolorimetrischen Assays quantifizieren. Um eine ordnungsgemäße Spalte Bildung und Reproduzierbarkeit, sind 2-ul-Proben für Protein-Proben empfohlen. Beachten Sie die folgenden JoVE Video: Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung Mit dem NanoDrop Spektralphotometer https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

1. Um zu demonstrieren, mit hoher Empfindlichkeit Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung mit dem NanoDrop 3300, ist ein PicoGreen Fluoreszenz-Kit verwendet. Um zu beginnen, äquilibrieren dem Kit-Standards und aller Nukleinsäure-Proben auf Raumtemperatur. Fluoreszierende Proben sind lichtempfindlich und sollte in Bernstein oder Aluminium verpackt Röhren gehalten werden.
2. Bereiten Sie genug 1x TE-Puffer für alle Standards und Proben sowie für die PicoGreen funktionierende Lösung, die benötigt werden, gemessen werden. Bereiten 1xTE Puffer durch Verdünnen der bereitgestellten 20x TE-Puffer mit Nuklease-freiem Wasser pro Protokoll des Herstellers. Reaction Volumes können aus 200 ul, so wenig wie 10 ul-Bereich. In diesem Beispiel werden 10 ul Reaktionsvolumen vorbereitet werden.
3. Bereiten seriell verdünnt dsDNA-Standards bei 2x die endgültige gewünschte Konzentration in Nuklease-freies Fläschchen oder Tuben. Transfer-5 ul der verdünnten dsDNA-Standards in einen einzelnen markierten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Röhre.
4. Aliquot 5 ul jeder dsDNA Probe von Interesse in entsprechend gekennzeichneten Nuklease-freies Bernstein oder Folie abgedeckten Rohre.
5. Bereiten PicoGreen funktionierende Lösung nach dem Protokoll des Herstellers. Übertragung der gleichen Menge des PicoGreen funktionierende Lösung in jedes Röhrchen, die entweder eine Standard-oder Probe von Interesse (5 ul in diesem Beispiel).
6. Die gleiche Menge 1x TE-Puffer und PicoGreen funktionierende Lösung, die negative Kontrolle, die als Referenz-Lösung dient vorzubereiten.
7. Mischen Sie die Inhalte der einzelnen Reaktionsgefäß durch leichtes Pipettieren und inkubieren Sie die Reaktionen bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Alle Standards und Proben sollten äquilibriert auf die gleiche Temperatur vor der Messung der Fluoreszenz-Signal von der Temperatur beeinflusst wird.
8. Zur Vorbereitung der Instrumente und Messungen durchführen, zuerst reinigen Sie den unteren und oberen Flächen der Probe Rückhaltesystem. Pipettieren von 2 bis 3 ul entionisiertem Wasser auf die untere optische Oberfläche, in der Nähe öffnen Sie dann den Hebelarm, und tupfen Sie den oberen und unteren Sockel mit einem sauberen, fusselfreien, wischen Labor. Sicherstellen, dass die Oberflächen sind frei von Flusen, bevor Sie fortfahren wie Flusen weisen in Gegenwart von einer Anregungsquelle Fluoreszenz und kann die Messung stören.
9. Öffnen Sie den Geräte-Software, wählen Sie die "Nukleinsäuren" Anwendung, und wählen Sie die "PicoGreen-dsDNA"-Option.
10. Um leere das Instrument, fügen Sie 2 &mgr; l 1x TE auf den unteren Sockel, in der Nähe der Arm, und wählen Sie "Blank" in das Instrument Software-Bereich. Einmal leer abgeschlossen ist, abtupfen der Blindprobelösung von beiden Oberflächen der Probe Rückhaltesystem.
11. Mix der Referenz-Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. Mit geringer Retention, Pipette 2 ul auf den unteren Sockel und schließen Sie den Arm.
12. Wählen Sie "Referenz" in die Messung ein, und wählen Sie die gewünschten Einheiten. Klicken Sie auf "Messen" der Messzyklus zu initiieren.
13. Wenn der Messzyklus abgeschlossen ist, öffnen Sie den Arm und gründlich abtupfen der Probe Rückhaltesystem Oberflächen. Distanzen bis zu fünf Wiederholungen der Referenz, mit einem frischen Aliquot für jede Wiederholung.
14. Wiederholen Sie den Vorgang für die weiteren Standards, um eine Standardkurve zu erstellen. Bis zu sieben Standards verwendet werden. Die Software wurde entwickelt, um bis zu fünf Wiederholungen für jede Norm. Repliziert der Standards werden gemittelt, um eine Standardkurve aus dem die Probe Konzentrationen automatisch ermittelt werden zu generieren.
15. Sobald der Standard-Kurve abgeschlossen ist, wählen Sie die "Samples" Registerkarte, geben Sie die jeweilige Probe-ID-Informationen und messen jede unbekannte Probe.

Diskussion

Die Quantifizierung Protokolle hier präsentiert werden, auf die am meisten akzeptierte Mikrovolumens Systemen. Derartige Systeme bieten eine praktische Alternative für traditionelle Nukleinsäure Quantifizierung Methodik, die auf größere Probenvolumina und den Einsatz von Containment-Apparat angewiesen.

NanoDrop Mikrovolumens Technologie verwendet eine Probe Rückhaltesystem, das auf die Oberflächenspannung Eigenschaften der Probe gemessen, um eine Flüssigkeitssäule Form setzt. Es ist wichtig, dass die Probe Kontakt mit dem oberen und unteren optische Messung Flächen für die richtige Spalte Bildung. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt die Messergebnisse ungenau oder nicht reproduzierbar scheint, ist es sehr wahrscheinlich das Ergebnis der Probe Heterogenität oder Flüssigkeitssäule Bruch.

Wasch-und Isopropylalkohol werden nicht empfohlen, Reinigungsmittel, da sie das Podest Messflächen kann bedingungslos. Eine unbedingte Podest tritt auf, wenn die hydrophobe Oberfläche Eigenschaften des Sockels kompromittiert wurden, was zu einer Abflachung der Probe Tropfen. Unconditioned Sockel kann zum Bruch der Flüssigkeitssäule während der Messung führen.

Abbildung 3. Unconditioned Oberfläche wird durch eine Abflachung eines Wassertropfens aus.

Uncondtioned Sockel Oberflächen können überholt mit NanoDrop Pedestal Überholung Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products) werden. Eine dünne Schicht der Wiederaufbereitung Verbindung der oberen und unteren Sockel Oberflächen, dürfen für ~ 30 Sekunden trocken angewendet wird, dann abgerieben mit einem sauberen, trockenen, fusselfreien Tuch Labor. Ein erfolgreich überholt Zustand wird durch einen Wassertropfen Sicken auf, wenn auf den Boden Sockel Oberfläche aufgebracht wird.

Abbildung 4. Ein erneuerter Oberfläche wird durch eine Sicke bis eines Wassertropfens aus.

Mikrovolumen Quantifizierung Systemen erheblich reduzieren Probe Verbrauch und einem dramatischen Anstieg der Konzentrationsbereich, wenn zu traditionellen Quantifizierung Systeme verglichen. Obwohl Mikrovolumens Quantifizierung ist oft eine grundlegende Technologie für bestimmte Umstände wie begrenzt Zellmasse wie Nadel-Biopsien und Laser-Mikrodissektion, die Effizienz und Einfachheit der Anwendung dieser Methode hat es eine weithin akzeptierte Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methoden werden auch wenn Probe ist reichlich.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-2000C
NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300