Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Abstract

Dynamische Veränderungen der intrazellulären Calcium-Konzentration als Reaktion auf verschiedene Reize reguliert viele zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose ^1. Während der Apoptose, Kalzium Akkumulation in den Mitochondrien fördert die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien ins Cytosol ^2. Es ist daher von Interesse direkt zu messen mitochondriale Kalzium in lebenden Zellen in situ während der Apoptose. Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung von Zellen mit Dual-Anregung ratiometrische und nicht ratiometrisch synthetische Calcium-Indikator-Farbstoffen beladen ist nachgewiesen worden, ein zuverlässiges und vielseitiges Werkzeug, um verschiedene Aspekte des intrazellulären Calcium-Signalgebung zu studieren. Mess-cytosolische Calcium Flüsse mit diesen Techniken ist relativ einfach. Die Messung intramitochondrialem Kalziumspiegel in intakten Zellen mit synthetischen Calcium-Indikatoren wie rhod-2 und rhod-FF ist eine größere Herausforderung. Synthetische Indikatoren gezielt an die Mitochondrien haben Antworten auf wiederkehrende Anstieg der mitochondrialen Kalzium-abgestumpft, und stören Mitochondrienmorphologie ^3. Zudem neigen synthetische Indikatoren ein Austreten aus den Mitochondrien über mehrere Stunden, die sie ungeeignet für langfristige Experimente macht. So haben genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren auf grün fluoreszierende Protein (GFP) ⁴ oder ⁵ Aequorin gezielt an die Mitochondrien basiert stark Messung des mitochondrialen Kalzium Dynamik erleichtert. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse in Reaktion auf verschiedene Reize. Die Methode basiert auf der Fluoreszenzmikroskopie von "ratiometrische-PERICAM", die selektiv an die Mitochondrien ist gezielt auf. Ratiometric PERICAM ist ein Kalzium-Indikator auf eine Verschmelzung von zirkular permutiert gelb fluoreszierendes Protein Calmodulin und ⁴ basiert. Die Bindung von Kalzium zu ratiometrische PERICAM bewirkt eine Verschiebung der Anregungs-Spitzenwert von 415 nm bis 494 nm, während das Emissionsspektrum, die Gipfel rund um 515 nm, bleibt unverändert. Ratiometric PERICAM bindet ein einzelnes Kalzium-Ionen mit einer Dissoziationskonstante in vitro von ~ 1,7 uM ^4. Diese Eigenschaften der ratiometrische PERICAM erlauben die Quantifizierung der schnelle und langfristige Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium-Konzentration. Darüber hinaus beschreiben wir die Anpassung dieser Methode auf einem Standard-wide-field Kalzium-Imaging-Mikroskop mit gängigen Filter-Sets. Mit zwei verschiedenen Agonisten, die purinergen Agonisten ATP und Apoptose-induzierenden Medikamenten Staurosporin zeigen wir, dass diese Methode geeignet zur Überwachung von Änderungen in der mitochondrialen Kalzium-Konzentration mit einer zeitlichen Auflösung von Sekunden bis Stunden. Darüber hinaus haben wir auch zeigen, dass ratiometrische PERICAM ist auch nützlich für die Messung mitochondrialen Spaltung / Fragmentierung während der Apoptose. So ist ratiometrisch PERICAM besonders gut für die langfristige, kontinuierliche Messung des mitochondrialen Kalzium-Dynamik während der Apoptose geeignet.

Protocol

1. Pericam-mt Transfektion und Cell Preparation.

1. Platte HeLa-Zellen der Nacht vor der Transfektion auf sterile Deckgläschen in einem Standard-6-well-Kulturplatte gelegt.
2. Bereiten DNA / Lipofectamine 2000 Komplexe, wie vom Hersteller (Invitrogen) vorgeschlagen. Wir verwenden 4 pg ratiometrische-PERICAM-mt Expressionsvektor und 10 ul Lipofectamine 2000 in 0,5 ml Opti-MEM für jedes Well verdünnt. Die Zellen sollten ~ 70% konfluent vor der Transfektion werden.
3. Ersetzen HeLa Kulturmedien (Dulbecco modifiziertem Eagles Medium, 10% FBS, Penicillin / Streptomycin) in jedes Well mit 1,5 ml des gleichen Medium ohne Antibiotika.
4. Fügen Sie die DNA / Lipofectamine Komplexe in jede Vertiefung zu transfiziert werden. Vorsichtig mischen mit Schaukeln und inkubieren für 4 Stunden in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ^o C, 5% CO _2.
5. Ersetzen Antibiotika-freien Medien mit Nährmedien mit Antibiotika. Lassen Zellen ratiometrische PERICAM für 1-2 Tage vor Imaging auszudrücken.

2. Mikroskop-Setup und Image Acquisition

1. Legen Sie ein Deckglas mit HeLa-Zellen in einem geeigneten bildgebenden Kammer mit Imaging-Lösung: 107mm NaCl, 7,2 KCl, 1,2 mm MgCl _2, 1 mM CaCl _2, 11,5 Glucose, 0,1% Rinderserumalbumin und 20 mM HEPES 7,2. Unser Labor verwendet die Attofluor Zellkammer von Invitrogen. Montieren Sie den Imaging-Kammer in einem inversen Mikroskop Bühne.
2. Finden Sie einen Bereich von Interesse mit einer oder mehreren Zellen, die ratiometrische PERICAM mit einem 40x (oder höher) Ölimmersionsobjektiv. Wir haben festgestellt, dass ratiometrische PERICAM weniger resistent gegenüber bei 380 nm Bleichen ist, und damit wir diese Wellenlänge, geeignete Zellen zu identifizieren. Für die Bilder in Abbildung 1 erworben wurde eine Nikon Superfluor 40X-Objektiv mit einem 1,3 numerische Apertur verwendet. Höhere Vergrößerung Ziele wäre auch angebracht (60-100x). Anregung Filter verwendet wurden Chroma Technology Filter D380/30x (380 + / - 30 nm) und D495/10 (495 + / - 5 nm), wurde Strahlteiler 505DCXR (505nm Langpass) und Emissions-Filter wurde HQ535/50m (535 + / - 25nm).
   Unser Mikroskop verwendet werden, um die Bilder in Abbildung 1 zu erwerben besteht aus einer Nikon TE2000 inversen Mikroskop mit einer Roper Scientific Coolsnap HQ gekühlte CCD-Kamera, Ludl MAC6000 schnelle Filterrad und-Wechsler und ein MetaFluor Datenerfassungs-und Analyse-Software ausgestattet. Dieses Protokoll kann auf jedem Standard-wide-field-Mikroskop mit den entsprechenden Filtern und Software in der Lage die Erfassung und Verarbeitung ratiometrische Bilder angepasst werden.
3. Richten Sie die Software für Dual-Anregung mit der 495 und 380 nm-Filter. Calcium-Bindung an ratiometrische PERICAM erhöht die Absorption bei 495 nm, also das Verhältnis sollte eingerichtet werden, bis 495 nm nm/380 werden.
   Ratiometric PERICAM hat einen Calcium-freier Anregung peak bei 415 nm ^4. In diesem Protokoll, empfehlen wir mit einem 380 nm-Filter nur, weil es überall in den meisten Calcium-Imaging Laboratories ist. Wenn ein 410 nm-Filter zur Verfügung steht, ist es vorzuziehen, die 380 nm-Filter.
4. Erwerben Sie Bilder der Reihe nach durch alternativ spannend bei 495 und 380 nm. Erwerben Sie Bilder von Baseline-Calcium-Spiegel für mindestens 30 s vor dem Auftragen von Agonisten über eine Perfusionsapparatur. Mark Zugabe für jeden Agonisten. Belichtungszeiten und Erwerb Abständen optimiert werden um zu verhindern Ausbleichen und trotzdem mit dem nötigen zeitlichen resolution.For Beispiel für semi-schnellen Calcium-Dynamik in Reaktion auf Agonisten Stimulation beobachtet werden, wurden die Bilder alle zwei Sekunden in den Abbildungen 1 B und C. Viel schneller Abtastraten erworben sind auch möglich ^6. Langfristige Bildgebung nach Staurosporin Verwaltung wurde mit einem längeren Intervall (30s) zwischen Akquisitionen (Abb. 1 D und E) erworben.

3. Bildverarbeitung und-analyse

1. Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, können erhaltenen Bilder offline analysiert werden. Definieren regions of interest (ROI), in dem Sie die Änderungen in Kalziumspiegel überwachen. Verwenden Sie einen ROI in einem leeren Bereich des Feldes ausgewählt Hintergrund subtrahieren, wenn nötig. Es wird darauf hingewiesen, dass die Mitochondrien sehr beweglich und dynamisch sind, und die Extrapolation Ereignisse in einem einzigen Mitochondrium über längere Zeiträume ist nicht immer möglich. So ist angesichts der hohen Beweglichkeit dieser Organellen in einigen Zelltypen, sollte die Auswahl der ROI sorgfältig überwacht werden. Darüber, wie in Abbildung 1, Mitochondrien Reaktion heterogen auf verschiedene Reize zeigt. Es ist daher wichtig zu analysieren, Daten offline und überwachen RO1 Platzierung auf einer Frame-by-Frame-Basis. Eine detaillierte Beschreibung der Mess-mitochondriale Kalzium in sehr beweglichen Mitochondrien wurde an anderer Stelle ⁷ beschrieben.
2. Erhaltene Verhältnis Messungen aus dem ROI lässt sich in Excel oder ähnlichen graphingsoftware importiert werden. Die Daten können als eine Spur vertreten Änderungen in der mitochondrialen Kalzium in einer einzigen Zelle oder einzelne Mitochondrien präsentiert werden, oder gemittelt fluorescence Signale von mehreren ROI. Wir haben auch diese Technik verwendet, um durchschnittlich mitochondriale Kalzium in einer Population von Lymphozyten Apoptose von Fas-Ligand ⁸ induzierte messen.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. (A) subzelluläre Lokalisation von ratiometrische-PERICAM-mt. Das erste Bild zeigt Live-HeLa Zelle, die ratiometrische-PERICAM-mt. Das zweite Bild zeigt Fluoreszenzfärbung mit Mitochondrien-selektiven Farbstoff MitoTracker Red CMXRos. Die gelbe Fluoreszenz in das zusammengefügte Bild zeigt Co-Lokalisation von ratiometrische-PERICAM-mt und MitoTracker Fluoreszenz. (B) Eine Reihe von Falschfarben-Verhältnis (495:380 nm) Bilder von 4 HeLa-Zellen, die mt-ratiometrische PERICAM mit 10 mM ATP behandelt . (C) Quantifizierung der Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium in die Region of Interest (ROI) in (B) mit 10 mM ATP. (D)-Serie von Falschfarben-Verhältnis (495:380 nm) Bilder einer HeLa Zelle, mt -ratiometrische PERICAM mit 0,5 uM Staurosporin behandelt. Heterogenität in der Calcium-Reaktion in einzelnen Mitochondrien ist evident, sowie erhebliche Fragmentierung der Mitochondrien durch 60 Minuten. Einige Mitochondrien oszillatorische steigt an Kalzium (weißer Pfeil Kopf), während andere dies nicht tun signifikanten Veränderungen in Calcium-Spiegel (gelber Pfeil Kopf). (E) Quantifizierung der Anstieg der globalen mitochondriale Kalzium in einem HeLa Zellen nach Induktion von Apoptose mit 0,5 uM Staurosporin.

Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine sehr einfache Methode zur Messung der mitochondrialen Kalzium mittels mitochondrialer gezielte ratiometrische PERICAM. Wie in Abbildung 1A dargestellt, mit Standard-Weitfeld-Optik ohne Dekonvolution ist es möglich, problemlos anzeigen einzelnen Mitochondrien in HeLa-Zellen mit akzeptablen Signal-Rausch-Verhältnis. Dies liegt daran, HeLa-Zellen, wie die meisten Zellen in Kultur, verflachen sich deutlich, wenn Anhänger wodurch der Bedarf für die konfokale Mikroskopie oder andere Spezialausrüstung. Wir haben ähnliche Ergebnisse in Jurkat-Zellen eingehalten Poly-Lysin beschichteten Deckgläsern ⁸ gefunden. Im Gegensatz zu Methoden unter Verwendung von Farbstoffen, ist es auch möglich, nicht-invasiv zu überwachen mitochondriale Kalzium für Stunden mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wie ratiometrische PERICAM (Abb. 1E). Dies ist besonders wichtig bei der Analyse von mitochondrialen Kalzium während Zelltod. Darüber hinaus ist es auch möglich, Kernspaltung / Fragmentierung der Mitochondrien in den apoptotischen Prozess zu visualisieren. Wie in Abbildung 1D-und E dargestellt, Ursachen Staurosporin-Behandlung eine langsame Zunahme an Kalzium in ausgewählten Subpopulationen von Mitochondrien, die Peaks bei 20 Minuten. Kalziumspiegel wieder hinunter mit mitochondrialen Fragmentierung gleichzeitige, bevor sie wieder 2 Stunden nach der Behandlung. Dies steht im Einklang mit den langsamen Wellen im cytosolischen Calciumkonzentration durch Staurosporin Behandlung gemessen mit Fura-2 ⁹ induziert. So können wichtige kinetische Informationen erhalten, die nicht mit Methoden unter Verwendung von statischen Messungen möglich werden. Obwohl wir Verhältnisse und nicht Calciumkonzentrationen in Abbildung 1 dargestellt haben, ist es möglich, den Sensor in situ zu kalibrieren, um absolute Kalziumspiegel ^{4, 10} zu berechnen. Eine wichtige Einschränkung zu beachten ist, dass ratiometrische PERICAM empfindlich auf pH ^{4, 10} ist. Da beide zytosolischen und mitochondrialen pH-Werte dramatisch verändern können während der Apoptose ^11, ist dies ein wichtiger Gesichtspunkt. Titration von pH-Wert im isolierten Mitochondrien Ausdruck PERICAM zeigen, dass steigende [H ^+] erhöht Emission von PERICAM, wenn bei 495 nm angeregt, mit wenig Wirkung auf die Emission durch Anregung bei 410 nm, eine Eigenschaft, die ausgenutzt worden ist, um gleichzeitig die beiden mitochondrialen Kalzium stimuliert und pH ^12. So selektiv Monitoring-Emission mit 410 nm Anregung bietet die Möglichkeit, nicht-ratiometrisch Monitor mitochondriale Kalzium mit reduzierter Sorge für pH-Wert. Schließlich das Protokoll hier vorgestellten erfordert nur Zugang zu einem Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop mit weithin verfügbaren Filter, wodurch diese Technik zugänglich meisten Labors.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverses Weitfeld-Fluoreszenz-Calcium-Bildgebungsmikroskop	Nikon Instruments	MEA53310	Jedes inverse Weitfeldmikroskop, das mit 380 nm/495 nm Anregungsfiltern und einem entsprechenden Langpass- und Emissionsfilter ausgestattet ist, kann problemlos an dieses Protokoll angepasst werden.
Imaging Software	Molecular Devices	Metafluor
Attofluor Zellkammer	Invitrogen	A-7816	Jede Bildgebungskammer für ein inverses Mikroskop, die eine Perfusion ermöglicht, wäre ausreichend.
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	meisten Transfektionsreagenzien/-protokolle wären für diese Studien geeignet
MitoTracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512