Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Zusammenfassung

Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

Zusammenfassung

Definition der subzellulären Verteilung von Signalkomplexen ist zwingend notwendig, um das Verständnis der Ausgang aus diesem Komplex. Herkömmliche Methoden wie Immunpräzipitation liefern keine Informationen über die räumliche Lokalisierung der Komplexe. Im Gegensatz dazu überwacht BIFC das Zusammenspiel und die subzelluläre Kompartimentierung der Protein-Komplexen. In diesem Verfahren wird eine fluororescent Protein in Amino-und Carboxy-terminalen nicht-fluoreszierenden Fragmente, die dann auf zwei Proteine ​​von Interesse sind verschmolzen aufgeteilt. Die Wechselwirkung der Proteine ​​führt zu Wiederherstellung des Fluorophors (Abbildung 1) ^1,2. Eine Einschränkung der BIFC ist, dass sobald die fragmentierte Fluorophor rekonstituierte die komplexen irreversible ³ ist. Diese Einschränkung ist von Vorteil bei der Erkennung vorübergehend oder schwachen Wechselwirkungen, sondern schließt eine kinetische Analyse der komplexen Dynamik. Eine weitere Einschränkung ist, dass die rekonstituierte flourophore 30min, um zu reifen und fluoreszieren erfordert, wieder ausschließt die Beobachtung von Echtzeit-Interaktionen ^4. BIFC ist ein konkretes Beispiel für das Protein-Fragment Komplementation Assay (PCA), die Reporter-Proteine ​​wie grün fluoreszierende Protein-Varianten (BIFC), Dihydrofolatreduktase, b-Lactamase und Luciferase an Protein zu messen beschäftigt: Protein-Interaktionen ^5,6. Alternative Methoden zur Protein-Studie: Protein-Interaktionen in Zellen gehören Fluoreszenz-Co-Lokalisation und Förster resonance energy transfer (FRET) ^7. Für Co-Lokalisation, sind zwei Proteine ​​einzeln entweder direkt mit einem Fluorophor oder durch indirekte Immunfluoreszenz markiert. Allerdings führt dieser Ansatz zu hohen Hintergrund an nicht-interagierenden Proteinen macht es schwierig, Co-Lokalisation Daten zu interpretieren. Darüber hinaus aufgrund der Grenzen der Auflösung der konfokalen Mikroskopie können zwei Proteine ​​scheinen, ohne notwendigerweise interagierenden co-lokalisiert. Mit BIFC wird die Fluoreszenz nur beobachtet, wenn die beiden Proteine ​​von Interesse zu interagieren. FRET ist eine weitere hervorragende Methode zur Untersuchung von Protein: Protein-Interaktionen, kann aber technisch anspruchsvoll. FRET Experimente erfordern die Donor-und Akzeptor ähnlicher Helligkeit und Stöchiometrie in der Zelle. Darüber hinaus muss man für das Durchschlagen der Spender-Konto in die Akzeptor-Kanal und umgekehrt. Im Gegensatz zu FRET hat BIFC wenig Hintergrundfluoreszenz, wenig Nachbearbeitung der Bilddaten, erfordert keine hohen Überexpression und kann schwache oder transiente Wechselwirkungen zu erkennen. Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) ist eine Methode ähnlich, außer der Spender ist ein Enzym (zB Luciferase), dass ein Substrat katalysiert zu werden Biolumineszenz so spannend Akzeptor FRET. BRET fehlen die technischen Probleme der Durchscheinen und hohe Hintergrundfluoreszenz es fehlt jedoch die Fähigkeit, räumliche Informationen durch das Fehlen von Substrat-Lokalisierung auf bestimmte Fächer ⁸ bereitzustellen. Insgesamt ist BIFC eine hervorragende Methode zur Visualisierung von subzelluläre Lokalisation von Protein-Komplexe, um Einblick in compartmentalized Signalisierung zu gewinnen.

Protokoll

A. BIFC Calibration

1. Wählen Sie ein Fluorophor. Es gibt mehrere Fluorophore, wie YFP und Venus, die gut funktionieren, wie BIFC Fusionspartner (Tabelle 1). Amino-und Carboxy-terminalen Enden der Venus sind in der Lage, ein komplexes bei 37 ° C zu bilden, während die YFP BIFC Fragmente eine Vorinkubation erfordern bei 30 ° C, um Fluorophor Bildung ^{2 zu} erleichtern. Diese Inkubation bei niedriger Temperatur verändern können einige zelluläre Prozesse und sollten berücksichtigt werden bei der Auswahl Fragmente. Vektoren für die Absicherung Venus zum Carboxy-Terminus von Proteinen aus Addgene (verfügbar

Diskussion

BIFC ist eine hervorragende Methode zur Visualisierung von Protein: Protein-Interaktionen in ganzen Zellen und die Bestimmung der subzellulären Lokalisation dieser Komplexe. Die Vorteile der BIFC sind, dass nur interagierende Proteine ​​fluoreszierend sind, sind vergänglich Wechselwirkungen stabilisiert, und Post-Processing der Bilddaten ist minimal. Zwei Nachteile dieser Methode sind die Reifezeit für den Fluorophor und die Unumkehrbarkeit des Fluorophor-Komplex. Unter bestimmten Anwendungen dieser Unumkehrbarkeit kann.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Cellgro	10-013
Fötales Rinderserum	Cellgro	35-011-CV
Glasboden-Mikroteller	Matek	P35G-1.5-14C
6-Loch-Teller	Falcon BD	35-3846
Lipofectamine	Invitrogen	18324020
PBS	Cellgro	21-031-CV
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Konfokales Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.	LSM510 META