Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

Zusammenfassung

Eine Technik ist beschrieben, um die in vivo physiologische Reaktion von Säugetieren Neuronen während der Bewegung zu quantifizieren und zu korrelieren die Physiologie des Neurons mit neuronalen Morphologie, neurochemischen Phänotyp und synaptischen Mikrotechnik.

Zusammenfassung

Die Rolle der einzelnen Neuronen und ihre Funktion in neuronalen Schaltkreisen ist grundlegend für das Verständnis der neuronalen Mechanismen der sensorischen und motorischen Funktionen. Die meisten Untersuchungen des sensomotorischen Mechanismen beruhen entweder auf Untersuchung von Neuronen während eines Tieres ist statisch ^1,2 oder aufzeichnen extrazelluläre neuronale Aktivität während einer Bewegung. ^3,4 Während diese Studien der fundamentale Hintergrund für Sensomotorik Verfügung gestellt haben, sie entweder nicht beurteilen funktionelle Informationen die auftritt, während einer Bewegung oder sind in ihrer Fähigkeit zur vollständigen Charakterisierung der Anatomie, Physiologie und neurochemischen Phänotyp des Neurons begrenzt. Eine Technik ist hier die erlaubt umfangreiche Charakterisierung von einzelnen Neuronen während einer in vivo Bewegung gezeigt. Diese Technik kann nicht nur zur primären afferenten Neuronen zu studieren, sondern auch für Motoneuronen und sensomotorischen Interneuronen zu charakterisieren. Zunächst die Antwort eines einzelnen Neurons aufgezeichnet wird mit elektrophysiologischen Methoden bei verschiedenen Bewegungen des Unterkiefers durch die Bestimmung der rezeptiven Feld für das Neuron gefolgt. Eine neuronale Tracer wird dann intrazellulär in das Neuron injiziert und das Gehirn ist so verarbeitet, dass das Neuron kann visualisiert werden mit Licht-, Elektronen-oder konfokalen Mikroskopie (Abb. 1). Die detaillierte Morphologie des Neurons charakterisiert wird dann umgebaut, so dass neuronale Morphologie mit der physiologischen Reaktion des Neurons (Abb. 2,3) korreliert werden können. In dieser Mitteilung wichtiger Schlüssel Details und Tipps für eine erfolgreiche Umsetzung dieser Technik sind vorhanden. Können wertvolle Zusatzinformationen für das Neuron unter Studie durch die Kombination dieser Methode mit anderen Techniken bestimmt werden. Retrograde neuronale Markierung kann verwendet werden, um Neuronen zu bestimmen, mit denen die markierten Neuronen Synapsen; so dass detaillierte Bestimmung der neuronalen Schaltkreise. Immunocytochemistry Mit dieser Methode können kombiniert werden, um Neurotransmitter innerhalb der markierten Neuronen zu untersuchen und die chemische Phänotypen von Neuronen, mit denen die markierten Neuronen Synapsen bestimmen. Die markierten Neuron kann auch für die Elektronenmikroskopie aufbereitet werden, um die ultrastrukturelle Merkmale und Mikrotechnik der markierten Neuronen zu bestimmen. Insgesamt dieser Technik ist eine leistungsfähige Methode, um gründlich zu charakterisieren Neuronen während in vivo Bewegung wodurch erhebliche Einblick in die Rolle des Neurons in Sensomotorik.

Protokoll

1. Tierische Vorbereitung

1. Anesthetize Ratte mit Natrium-Pentobarbital (50mg/kg IP) und auf ein Heizkissen. Shave die Haut über der hinteren Schädel mit Tierschermaschinen. Überprüfen Sie das Tier zu gewährleisten, dass eine chirurgische Maß an Niveau der Narkose durch die Prüfung wurde für das Fehlen eines Rücktritts Reflex und Vokalisation erhalten, wenn die Zehen geklemmt sowie das Fehlen einer Augenlidreflexe sind. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie alle 15 Minuten und Aufrechterhaltung einer chirurgischen Niveau anesthetisa durch die Injektion von Natrium-Pentobarbital 15mg/kg alle 45 Minuten.
2. Unter aseptischen Bedingungen arbeiten und einen Einschnitt in der Leistengegend direkt distal der Falte durch den Bauch und Innenseite der Oberschenkel gebildet und legen Sie eine Kanüle (1 mm Durchmesser, Clay Adams) in die V. femoralis und A. femoralis. Machen Sie einen Medianschnitt in der Submandibulärregion, spiegeln die infrahyoideus. Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre und legen Sie eine Kanüle (2 mm Durchmesser), um Belüftung zu ermöglichen. Tye eine Naht um den trachael cannual, um es in place.Monitor systemischen systolischen und diastolischen Blutdrucks über die arterielle Kanüle zu sichern. Neben der Überwachung der Rücknahme-und Augenlidreflexe jetzt den Blutdruck zu beobachten, um das Niveau der Anästhesie zu beurteilen. Verwalten zusätzliche Betäubung, wenn über die venöse Kanüle nötig.
3. Legen Sie die Ratte in einen stereotaktischen Rahmen und führen Sie eine Kraniotomie an das Kleinhirn freizulegen. Bringen Sie die Trachealkanüle ein Nagetier Ventilator. Lüften Sie das Tier mit einem Volumen von 2 cm ³ mit einer Geschwindigkeit von 100/min mit feuchter Luft. Eine positive endexspiratorischer Druck von 1 cm H ₂ O sollte beibehalten werden, um Lungen-Kollaps zu verhindern. Alle 15 Minuten Hyperinflation der Lunge zu Atelektasen zu verhindern. Dann bedecken die Oberfläche des Gehirns mit warmen Mineralöl (30 ° C). Achten Sie darauf, die großen venösen Sinus direkt unter der Kreuzung zwischen der parietalen und interparietalen Knochen entfernt zu vermeiden.
4. Bewerben Sekundenkleber auf einen Stab gekoppelt mit einem elektromagnetischen Vibrator und befestigen Sie die Stange in das Diastema des Kiefers. Bewegen Sie den Unterkiefer mit dem Befehl signalisiert dem Vibrator entweder von einem A / D-Computer-Ausgang oder einen Signalgenerator.
5. Legen Sie eine siliver-Silberchlorid Erdungselektrode unter die Haut neben der Kraniotomie.

2. Electrode Vorbereitung

1. Fertigen Mikroelektroden aus Quarz oder Aluminosilicatglas mit einer horizontalen Mikroelektroden Abzieher.
2. Füllen Sie den Mikroelektroden mit 5-10% biotinamide in 0,25 M KCl und 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) oder 2% tetramethlyrhodamine in Kochsalzlösung (pH 6) aufgelöst. Überprüfen Sie Elektrodenimpedanz mit einer Elektrode Tester. Zur Aufnahme von großem Durchmesser Axone machen Elektroden mit einer Impedanz von 60-80M Ω, für kleine Axone und Interneuronen machen Elektroden mit einer Impedanz von 80-150MΩ.
3. Legen Sie die Mikroelektroden in den Kopf der Bühne des Elektrometers. Visualisieren Sie die Elektrode durch ein kleines Teleskop (20X mit einer geschlossenen Absehen), die in der Position hinter den Kopf des Tieres fixiert ist. Mit dem Teleskop ist wichtig, weil sie Elektroden an stereotaxically mit großer Präzision positioniert werden können.

3. Elektrophysiologische Aufzeichnung und intrazelluläre Färbung

1. Machen Sie eine kleine Öffnung in der pia mater und überkompensieren die Kapazität Feedback, so dass, wenn die Elektrode im Gehirn berührt ein Feedback-Signal erzeugt wird. Dies ermöglicht die genaue Lage der Oberfläche des Gehirns.
2. Produce wiederholt mandibuläre Verlagerung und vor der Elektrode in das Gehirn mit einem Schrittmotor.
3. Erkennen neuronalen Pfählungen durch plötzliche DC-Potential und identifizieren intrasomatic neuronalen Pfählungen durch laufende synaptische Aktivität. Buzzing die Elektrode mit einer Überkompensation der Kapazität oder Klopfen selten zu einem erfolgreichen Zellpenetration. Aufgrund der hohen Impedanz der Elektroden sind neuronale Reaktionen selten vor, um das Eindringen beobachtet.
4. Nachdem Sie ein Neuron und spießen das Eindringen gilt als stabil, charakterisieren die neuronale Antwort mit Rampe und halten und sinusförmige Kieferbewegungen. ⁵ Karte der rezeptiven Feld des Neurons durch Untersuchung der Haut rund um die Kopf-und intra Mundhöhle mit einem nicht leitenden Sonde wie einen Holzstab. Wenn die für die Studie untersuchen die Reaktion des Neurons an andere funktionell relevanter Reize wie Muskelkontraktion und Schmerzreize. ⁶ primären afferenten nozizeptiven neuronalen Rezeptoren reagieren auf nozizeptive Reize. Allgemeine anesthesetics wie Natrium-Pentobarbital nicht blockieren axonalen Leitung in primären afferenten Neuronen, sondern drücken die synaptische Übertragung. So axonalen Leitung in der primären afferenten neuronalen Axon ist erhalten geblieben.
5. Inject Gleichstrom (DC, 1-4NA) für insgesamt Einspritzzeit von 15-70nA Minuten. Monitor-Elektrode Penetration während Stromeinspeisung und einzustellen, wenn Membranpotential positiver als-30mV.

4. Tissue Verarbeitung

1. Euthanize das Tier durch Überdosis Pentobarbital (140mg/kg IV) und perfuse mit einer vaskulären spülen (0,9% NaCl 38 ° C mit 500 Einheiten Heparin und 1 ml 2% Xylocain gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) .
2. Entfernen Sie das Gehirn und § es bei 50-100 um mit einer Vibratom entweder in der Frontal-, Sagittal-oder Horizontalebene. Secions frei schwebend in 25 ° C PBS gesammelt.
3. Prozess im Gehirn für DAB durch Inkubation bei 1-2% normalem Ziegenserum und 1% Triton X-100 in 0,01 M PBS gefolgt von einer Inkubation in Avidin Biotin-Komplex (1:50 Elite Vectastain). React Abschnitte mit Nickel-DAB mit H ₂ O _2. Zur Bearbeitung für Texas Red, inkubieren Abschnitte in Avidin-Biotin-Komplex (1:50) in PBS über Nacht bei 4 ° C und dann in 4% Texas Red Avidin DCS in PBST bei 4 ° C über Nacht inkubieren. Gegenfärbung Abschnitte mit einem fluoreszierenden Nissl-Färbung (NeuroTrace) 20min bei 23 ° C.
4. Wenn Neuron mit Rhodamin injiziert wurde, visualisieren die injizierten Neuron direkt mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (Ex 545nm).

5. Die Kombination Methode mit retrograde Markierung, Immunzytochemie, konfokale Bildgebung, quantitative Kolokalisationsanalyse

Den Erfolg dieser Kombination dieser Technik mit anderen Methoden ist weitgehend abhängig von guten intrazellulären Kennzeichnung.

1. Die Methode visualisiert hier kann leicht mit retrograde neuronale Markierung kombiniert werden. ^7-10 Um dies zu tun, betäuben das Tier und unter aseptischen Bedingungen injizieren eine neuronale Tracer wie Meerrettichperoxidase (20% Meerrettichperoxidase. Sigma VI, Sigma) und 1% Weizenkeimöl aggultinated Meerrettichperoxidase (Sigma) in peripheren Zielregionen wie M. masseter. Diese neuronale Tracer wird bis in die peripheren Axone aufgenommen und transportiert werden via axonalen Transport zu den Motoneuronen Somata. Für die Kaumuskel ist 15μl der Tracer in den Muskel mit einer sterilen 10 Mikroliter Mikrospritze injiziert. Die Tiere werden dann auf einem Heizkissen gelegt und überwacht werden, bis aus der Narkose erholt und dann in ihren Käfigen für die Verwertung gelegt. Nach 24 Stunden, betäuben Tiere und physiologisch charakterisieren Neuronen und intrazellulär anzufärben. Dann versorgen die Tiere, wie oben und Prozess Gewebeschnitten für die Anwesenheit von HRP mit Tetramethylbenzidin (TMB) als Chromagen und Natriumwolframat als Stabilisator und verstärkte mit Kobalt beschrieben. Legen Sie Abschnitte in 1% Natriumwolframat in 0,1 M PBS (pH 6,5) und 0,0007% TMB in absolutem Ethanol und Aceton bei 15, gelöst ° C für 20 min. Dann reagieren Gewebeschnitten durch Zugabe von 1,0 ml von 0,3% H ₂ O ₂ pro 100ml Inkubation für 60 min. Das Gewebe spülen in 0,1 M PBS (pH 6,5) und in 0,05% Diaminobenzidin (pH 7,4), 0,02% Kobalt und 0,01% H ₂ O ₂ in 0,1 M PBS (pH 7,4) für 10 min. bei 37 ° C. Prozess des Gewebes für die Visualisierung des Neurons mit biotinamide injiziert, wie beschrieben und visualisiert die Beziehungen zwischen der markierten sensorischen Neuronen und eine Vielzahl von Motoneuronen.
2. Die Technik hier gezeigt können auch leicht mit immnocytochemistry kombiniert werden. ⁶ Als ein Beispiel, immuncytochemisch Prozess des Gehirns für Synaptophysin, um genau zu lokalisieren Synapsen innerhalb markierter Neuronen (Abb. 3). Um dies zu tun, inkubieren Hirnschnitten in Maus-anti-Synaptophysin-Antikörper (1:10.000) für 2 Tage bei 4 ° C und dann in anti-Maus-FITC (1:400) inkubiert 1 h bei 23 ° C.
3. Neuronen mit fluoreszierenden Markern versehen oder verarbeitet für Fluoreszenz-Imaging sind ideal für die konfokale Bildgebung. Abbildung 3 ist ein Beispiel für einen optischen Schnitt mit der konfokalen Mikroskopie durch ein Axon bouton erhalten. (Abb. 3). Generieren Sie Animationen der markierten Neuronen durch den Erwerb mehrerer optische Schnitte durch die markierte Neuron (Abb. 4).
4. Neuronen mit dieser Methode markiert werden können für quantitative Kolokalisationsanalyse verwendet werden. Um dies zu tun, verwenden Sie einen öffentlich zugänglichen Software Makro in Verbindung mit NIH Image (gefunden bei http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm). Localize Synaptophysin innerhalb einzelner Axonterminalen durch die Kombination von intrazellulären Markierung mit Synaptophysin Immunzytochemie. ⁶

6. Repräsentative Ergebnisse:

Eine Übersicht über die repräsentative Ergebnisse, die unter Verwendung dieser Methode werden können, sind in Abbildung 1 dargestellt. Diese einzelne Neuron Hirnstamms elektrophysiologisch war während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet und, wie deutlich zu sehen ist, war die Antwort des Neurons (Abbildung 1 unten links, hellblau) moduliert während der Bewegung. Dieses Neuron wurde mit biotinamide nach elektrophysiologischen Charakterisierung injiziert und anschließend zur Visualisierung verarbeitet. Die rekonstruierten Neuron (Abbildung 1 Mitte, grün) können realeTed einer anatomischen Landmarke, in diesem Fall den Trigeminus Nucleus bezeichnet (rote Umrandung). Basierend auf den neuronalen Reaktion während der Bewegung und des Wiederaufbaus dieses Neuron kann als sekundäre Muskel afferenten Neuron identifiziert werden. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Beispiel für die physiologische Reaktion eines Neurons im Kiefer Verschiebung. Die Reaktion des Neurons ist als Momentanwerte Schussfrequenz vertreten. Beachten Sie, dass die neuronale Antwort ahmt mandibuläre Verlagerung darauf hinweist, dass diese besondere Neuron sensorisches Feedback in Bezug auf die Lage des Unterkiefers bietet. Abbildung 3 ist ein hoher Vergrößerung Bild eines intrazellulär gefärbt Axon mit Färbung für Synaptophysin und Nissl-Färbung kombiniert. Beachten Sie die Kolokalisation von Synaptophysin (gelb) in das Axon bouton. Abbildung 4 ist eine Animation aus einem einzigen, physiologisch charakterisiert und intrazellulär markierten Neuronen.

Abbildung 1. Übersicht über die Methode. Oben links: mandibuläre Verlagerung. Middle Intrazelluläre Aufnahme (grün) aus einzelnen Neurons (gelb). Die Morphologie dieses Neuron wurde nach intrazellulärer Aufnahme und Injektion rekonstruiert. Rote Umrandung zeigt Lage der Trigeminus-motorischen Kern. Unten links: physiologische Reaktion dieser Neuronen während der Kieferbewegungen.

Abbildung 2. Representative physiologische Reaktion eines einzelnen Muskels sensorischen Neuronen in vivo während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet. Man beachte die Ähnlichkeit der neuronalen Antwort mit Kiefer Verschiebung.

Abbildung 3. Terminal-axonale Verzweigung mit synaptischen boutons (rote Schwellungen) eines intrazellulär gefärbt sensorischen Neuronen, die bei Muskel-Probing reagiert. Nachfolgende immunzytochemische Verarbeitung für Synaptophysin zeigt Lokalisierung von Synaptophysin in der axonalen bouton (gelb). Grün ist eine fluoreszierende Nissl-Färbung.

Abbildung 4. Animation der Muskelspindel primären afferenten Neuron Axon, dessen physiologische Reaktion wurde in vivo während der Bewegung des Unterkiefers aufgezeichnet wurde Das Axon dann intrazellulär gefärbt und verarbeitet für die Visualisierung.
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Diskussion

Das dargestellte Verfahren hier ist eine leistungsstarke Technik, die wichtige Einblicke in die Funktion der einzelnen Neuronen und wie die Reaktion einzelner Nervenzellen trägt zur neuronalen Schaltkreisen. ⁹ Dieses Wissen ist grundlegend für das Verständnis Sensomotorik. Die größte Stärke dieser Technik ist, dass es erlaubt die Bestimmung einer Vielzahl von Parametern zu einem Neuron einschließlich Physiologie, Morphologie und synaptische Morphologie und Verteilung. In Verbindung mit anderen Techniken wie r...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagens oder Ausrüstung	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
elektromagnetischen Vibrator	Ling Dynamic Systems	V101
Signalgenerator	Feedback-Systeme	PFG605	in der Lage, trapezförmigen Ausgangssignal
Elektrodenglas	Sutter Instruments	AF100-68 bis 10	mit Filament
Elektrode puller	Sutter Instruments	Modell P-2000 oder P-80
biotinamide	Vector Laboratories	SP-1120	Lagerung bei 4 ° C
Texas Red Avidin DCS	Vector Laboratories	A-2016
tetramethlyrhodamine	Molecular Probes	D-3308	3000 Molekulargewicht, Lysin feststellbar
Maus-anti-Synaptophysin-Antikörper	Chemicon	MAB5258
fluoreszierende Nissl-Färbung	Neurotrace, Molecular Probes	N-21480
Elektrode Tester	Winston Electronics	BL-1000-B	zu Elektrodenimpedanz messen
Elektrometer	Axon Instruments	Axoprobe 1A, 2B Axoclamp