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Nicotiana benthamiana Pflanzen werden in einem temperierten Klimakammer bei 25 ° C gewachsen. Voll ausgebaut gesunde Blätter von 3-6 Wochen alten Pflanzen verwendet werden.
Tipp: Bessere Ergebnisse werden mit neu entstehenden Blättern gewonnen
1. Agrobacterium vorübergehende Infiltration Protokoll:
Tag 1
- Streak LB / Rifampicin (25 ug / ml) / Kanamycin (100 ug / ml) Agarplatten mit Glycerin Aktien von Agrobacterium tumefaciens (Stamm LBA4404) mit den entsprechenden Vektoren mit dem Gen (s) zum Zelltod untersucht werden und der Vektor mit den GUS-Kassette unter einem konstitutiven Promotor. Enthalten immer eine leere Vektor-Regelung als negative Kontrolle.
- Inkubation bei 28 ° C für 2 Tage.
Tag 3
- Inoculate 2 ml LB mit Rifampicin (25 ug / ml) und Kanamycin (100 ug / ml) mit einer einzelnen Kolonie von jeder LB / Rifampicin / Kanamycin Platte zuvor gestreift.
- Inkubieren jede Kultur durch Schütteln bei 28 ° C für 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis ein maximales Wachstum Dichte erreicht ist.
Tipp: Horstig ist manchmal zu beobachten, in welchem Fall Kulturen gründlich resuspendiert werden (dh Auf-und Abpipettieren), bevor Sie fortfahren müssen.
Tag 4
- Nach der Inkubation erhöht das Gesamtvolumen auf 10 ml mit frischem LB (mit den entsprechenden Antibiotika) und Acetosyringon (Endkonzentration 25 uM).
- Inkubieren jede Kultur durch Schütteln bei 28 ° C für weitere 16 Stunden.
Tag 5
- Am nächsten Tag waschen jede Kultur zweimal durch Zugabe von 10 ml (fügen Sie keine Acetosyringon) Infiltration Medium (10 mM MgSO 4 .7 H 2 O, 9 mM MES, pH 5,6) und zentrifugieren bei 4000 xg für 10 min bei Raumtemperatur.
- Nach dem letzten Zentrifugationsschritt resuspendieren jede Kultur in 5 ml Medium mit Infiltration Acetosyringon (100 uM).
- Messen Sie die OD 600nm, werden die Messungen zwischen 0,1 und 0,9 zulässig.
Tipp: OD 600nm von nur 0,1 ohne Probleme verwendet wurden, können jedoch auch höhere OD produzieren mehr konsistente Ergebnisse. - Inkubieren Sie die Kulturen weitere 3 Stunden auf die Agrobacterium Kulturen zur Infektion vorzubereiten.
- Mix Kulturen, die das Gen (s) zu analysieren und die Negativ-Kontrolle (Agrobacterium mit dem leeren Vektor) in einem Verhältnis von 1:1 mit der Kultur, die das GUS-Kassette.
- Infiltrate der abaxialen (unter-) Seite neu entstehenden Blätter mit einer 1 ml nadellose Spritze (Abb. 1).
Tipp: Infiltrate sowohl die Negativ-Kontrolle-Gemisch (Leervektor + GUS-Kassette) und die Mischung, die das Gen zu untersuchenden (Gen x + GUS-Kassette) auf gegenüberliegenden Blätter der gleichen Pflanze. Verwenden Sie dreifach Pflanzen für jede Behandlung. - 3 Tage nach Infiltration Verbrauchsteuern infiltriert Blätter und Assay für GUS-Protein-Expression.
2. Histochemische GUS-Test
Tag 8
- Vacuum infiltrieren die X-Gluc Trägermedium in die ausgeschnittene Blätter.
- Inkubieren im Dunkeln über Nacht bei Raumtemperatur oder bis deutliche Blau-Färbung erscheint.
Tag 9
- Spülen in destilliertem Wasser.
- Inkubieren in 70% Ethanol bis Chlorophyll entfernt wird, dann Transfer zum destilliertem Wasser wieder. Optisch bewerten GUS-Expression Ebenen.
3. Fluorometric MUG-Assay:
Tag 8
- Isolieren gesamten Proteins durch Schleifen infiltriert Blattscheiben in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff. Add 100 uL der GUS-Extraktionspuffer (50 mM NaPi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-Lauroylsarcosin Natriumsalz, β-Mercaptoethanol (0,7 ul / ml), während die Probe auf Eis.
- Centrifuge Suspension bei 14.000 g für 5 min bei 4 ° C und nehmen Überstand als Gesamt-lösliches Protein.
- Measure-Konzentration mit Hilfe eines NanoDrop nach den Anweisungen des Herstellers.
- Passen Sie die Protein-Konzentration auf 100 ug Gesamt-lösliches Protein für jede Probe mit GUS-Extraktionspuffer.
- Add MUG Substrat (4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid Trihydrat) in GUS-Extraktionspuffer zu einer Endkonzentration von 2 mM hergestellt. Ein Gesamtvolumen von 100 mL pro Probe (Protein + MUG Substrat) sollte ausreichend sein.
- Inkubieren Sie die Reaktionen für 1 Stunde bei 37 ° C.
- Stop-Reaktionen durch Zugabe von 800 ul GUS Stop Puffer (0,2 M Na 2 CO 3).
- Messen Sie mit einem Fluoreszenz-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 455 nm und Werte vergleichen zu einem MU Standardkurve. Bericht Ebenen der GUS-Aktivität als nmol MU / ug gesamte lösliche Protein / min.
4. Stocks and Solutions:
- Acetosyringon (1 M) Aktie (FW = 196,2 g)
- Kanamycin (100 mg / ml) auf Lager - in dH vorbereiten 2 0 - Filter sterilisieren
- Rifampicin (25 mg / ml) auf Lager - in DMSO vorbereiten
- Luria-Bertani (LB) flüssige Nährmedien: (1L)
1% (w / v) Bacto-Trypton, 10 g
0,5% (w / v) Bacto-Hefeextrakt, 5 g
170 mM Natriumchlorid 10 g
pH - 7 - Acetosyringon (25 nM) = 25 ul einer 1 M Stammlösung in einem Endvolumen von 1 ml
- Infiltration Medium: (1L)
10 mM MgSO 4 .7 dH 2 0 (FW = 246,48 g), 2,4648 g
9 mM MES (FW = 213,25 g), 1,91925 g
pH - 5,6 - Acetosyringon (100 uM) = 100 ul einer 1M Lager in einem Endvolumen von 1 ml
- GUS-Extraktionspuffer
50 mM NaPi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-Lauroylsarcosin Natriumsalz, β-Mercaptoethanol (0,7 ul / ml) - 2x Phosphatpuffer
0,2 M NaH 2 PO 4 und 0,2 M Na 2 HPO 4 pH 7 - X-Gluc Substrat-Lösung
1 mg 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl bD-Glucuronid (X-Gluc) in 0,1 ml Methanol. 1 ml 2x Phosphat-Puffer, 20 ul 0,1 M Kaliumferricyanid, 10 &mgr; l Triton X-100 10% und 850 ul destilliertes Wasser.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Nach diesem Protokoll ist der Verlust der GUS-Expression zu erwarten, wenn Zelltod eintritt. Wir haben gleichzeitig das Reporter-Gen, β-Glucuronidase (GUS) mit einem Mitglied des Zyto-Schutz Arabidopsis Bcl-2 assoziierte athanoGene (BAG) Familie zum Ausdruck gebracht. Wir co-infiltriert N. benthamiana Blätter mit einem 35S angetrieben BAG Expressionskassette und die GUS-Vektor pCAMBIA 2301 unter Verwendung von Agrobacterium LBA4404. Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurde eine sichtbare Steigerung der GUS-Färbung nach dieser Infiltration beobachtet. Umgekehrt, wenn die bekannten pro-apoptotischen Mitglied der Bcl-2 Familie BAX verwendet wurde, war eine deutliche Reduktion der GUS-Färbung beobachtet werden (Abb. 2). In beiden Fällen wurde GUS-Expression sichtbar anders im Vergleich zur Kontrollgruppe. Allerdings, wenn der Unterschied im Ausdruck weniger offensichtlich ist, kann fluorometrische MUG-Assays durchgeführt, um GUS-Expression quanitate werden.
Abbildung 1. Beispiel Agrobacterium Mischung Infiltration der abaxialen Seite des N. benthamiana Blätter mit einer 1 ml nadellose Spritze.
Abbildung 2. A GUS-Vektor wurde in N. co-exprimiert benthamiana Blätter mit dem Anti-Todes-Gen, und ein bekannter Induktor von Zelltod. GUS-Spiegel wurden in ein leeres Vector-Regelung (GUS Kontrolle) verglichen.