Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung von mikrofluidischen Bauteilen, die Zelle zu erfassen und Kultur ermöglichen können. In diesem Ansatz gemusterten Mikrostrukturen wie Rillen in mikrofluidischen Kanälen werden verwendet, um Scherarmut Regionen, in denen Zellen andocken können erstellen.

Abstract

Wir beschreiben ein Mikrofluidiksystem mit microgrooved Muster für die Untersuchung zellulärer Verhalten. Diese mikrofluidischen Plattform besteht aus einem Oberteil Fluidikkanal und eine untere microgrooved Substrat. Zur Herstellung der microgrooved Kanäle, war ein Top-Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Form mit dem Eindruck der mikrofluidischen Kanälen ausgerichtet und verbunden mit einem microgrooved Substrat. Mit diesem Gerät, Maus-Fibroblasten-Zellen wurden fixiert und strukturiert innerhalb microgrooved Substrate (25, 50, 75 und 100 &mgr; m breit). Um die Apoptose in einer mikrofluidischen Vorrichtung Studie wurde Medium mit Wasserstoffperoxid, Annexin V und Propidiumiodid in die Fluidik-Kanal für 2 Stunden perfundiert. Wir fanden, dass Zellen, die den oxidativen Stress apoptotischen wurde. Diese apoptotischen Zellen wurden durch Annexin V bestätigt, dass an Phosphatidylserin an der äußeren Seite der Plasmamembran während der Apoptose-Prozess gebunden. Mit diesem mikrofluidischen Gerät mit microgrooved Muster wurde die Apoptose-Prozess in Echtzeit beobachtet und analysiert mit Hilfe eines inversen Mikroskops mit einer Inkubationszeit Kammer (37 ° C, 5% CO _2). Daher könnte dieses Mikrofluidiksystem mit microgrooved Substrate eingearbeitet werden für die Untersuchung der zellulären Verhaltens und Durchführung von Hochdurchsatz-Wirkstoffsuche.

Protocol

A. Microfabrication der Mikrofluidikvorrichtung

1. 4-Zoll-Si-Wafer ist mit reaktiven Sauerstoff-Plasma (5 min bei 30W, Harrick Scientific, NY) behandelt.
2. Negative Photolack (SU-8 2015 Microchem, MA) ist durch Spin-Coating bei 900 rpm für 1 min auf einem Si-Wafer.
3. Der Wafer ist weich gebacken bei 95 ° C für 6 min auf einer Heizplatte und wird mit UV-Licht (200W) für 4 min durch eine Maske Film mit Mikrokanälen ausgesetzt.
4. Der Wafer wird post bei 95 ° C gebacken für 6 min und entwickelt mit SU-8 Fotolack-Entwickler.
5. Der Fotolack strukturierten Wafer mit Mikrokanälen ist in einer Petri-Schale gelegt.
6. Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) (Sylgard 184) Formen werden durch Mischen Silikon-Elastomer und Härter (10:1 Verhältnis) hergestellt.
7. Die PDMS-Mischung wird auf die Si-Master gegossen und befindet sich auf einem Vakuumexsikkator, um Luftblasen zu entfernen platziert.
8. PDMS ist bei 70 ° C für 1 bis 2 Stunden ausgehärtet.
9. PDMS Formen werden dann von der Si Master-Form geschält.

B. Montieren Sie das Gerät

1. 40 um dicke top Fluidik-Kanäle und 40 um dicken Boden microgrooved Kanäle (25, 50, 75 und 100 μ m breit) sind aus zwei verschiedenen Si Master Formen erhalten.
2. Kanal Ein-und Auslass der fluidischen Gerät ausgestanzt werden.
3. Fluidic Kanäle und microgroove Kanäle sind irreversibel durch die reaktive Sauerstoff-Plasma (5 min bei 30W, Harrick Scientific, NY) gebunden.
4. Extrazellulären Matrix (ECM) (dh Fibronektin) ist in mikrofluidischen Gerät für 1 Stunde im Brutschrank (37 ° C) beschichtet.

C. Zellaussaat und Versuchsaufbau

1. NIH-3T3 Maus-Fibroblasten in einer Zellkulturflasche mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medien (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet.
2. Die Zellen werden trypsiniert und distanziert.
3. Dissoziierten Zellen werden in die microgroove Kanäle an der Zelldichte von 3 × 10 ⁶ Zellen / ml (Abbildung 1) geladen.
   
   
   Abbildung 1
   
   
4. 2 mL Medien, 100 mM H ₂ O ₂ und Apoptose-Assay (20 ul Annexin V und 40 ul Propidiumiodid, Invitrogen, CA) werden in einem Kanal mit Hilfe einer Spritzenpumpe (1 ml / min) infundiert.
5. Die Zellen werden in Echtzeit mit einem inversen Mikroskop (Nikon TE 2000) überwacht.

Discussion

Die Zellen wurden fixiert und strukturiert innerhalb microgrooved Substrate in einer mikrofluidischen Vorrichtung. Die Apoptose-Prozess von Zellen, die Wasserstoffperoxid in Echtzeit beobachtet und analysiert mit Annexin V und Propidiumiodid. So könnte dieses Mikrofluidiksystem mit microgroove Kanäle nützlich sein für das Hochdurchsatz-Wirkstoffsuche.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS-Reagenz		K.R. Anderson Co.	2065622	Poly(dimethylsiloxan), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 lb)
DMEM-Medium		Invitrogen	11965	Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medien
FBS-Serum		Invitrogen	10082-147	Fötales Rinderserum
Wasserstoffperoxid-Reagenz	Sigma-Aldrich	H1009
Apoptose-Assay		Invitrogen	V13242	Annexin A, Propidiumiodid
Negativer Fotolack		MicroChem Corp.	SU-8 2015
Si Wafer	Werkzeug			4 Zoll Silikonwafer
Reaktives Sauerstoffplasma-Reagenz	Harrick Scientific Products, Inc.			Wafer 5 min bei 30W
inversem Mikroskop	behandeln Werkzeug	Nikon Instruments	TE 2000