"Bioluminescent 'Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Zusammenfassung

Eine einfache Methode zur Identifizierung der prioritären bakteriellen Erregern ist gentechnisch Reporter Phagen verwenden. Diese Reporter-Phagen, die spezifisch für ihre besonderen Wirtsarten sind, sind in der Lage schnell Transduktion eines Biolumineszenz-Signal Antwort auf Wirtszellen. Hier beschreiben wir die Verwendung von Reporter Phagen für den Nachweis von Yersinia pestis.

Zusammenfassung

Yersinia pestis und Bacillus anthracis sind Kategorie A bakterielle Erreger, die die Erreger der Pest und Milzbrand sind jeweils ^1. Obwohl das natürliche Vorkommen beider Krankheiten "ist jetzt relativ selten sind, ist die Möglichkeit terroristischer Gruppen mit diesen Erregern als Biowaffe Echtzeit. Wegen der Krankheit innewohnende Kommunikationsfähigkeit, schnelle klinischen Verlauf und eine hohe Sterblichkeitsrate, ist es entscheidend, dass ein Ausbruch schnell erkannt werden. Deshalb Methoden, die eine schnelle Erkennung und Diagnose stellen sind unerlässlich, um eine sofortige Umsetzung der Maßnahmen des Gesundheitswesens und die Aktivierung des Krisenmanagements gewährleisten.

Rekombinante Phagen-Reporter kann einen schnellen und spezifischen Ansatz für den Nachweis von Y. pestis und B. anthracis. Die Centers for Disease Control and Prevention nutzen derzeit das klassische Phagen Lyse-Assays für die bestätigten Identifizierung dieser bakteriellen Erregern ^2-4. Diese Assays profitieren von natürlich vorkommenden Phagen, die spezifisch und lytisch sind für ihre bakteriellen Wirten. Nach Wachstum über Nacht der kultivierten Bakterien in Gegenwart der spezifischen Phagen, bietet die Bildung von Plaques (bakterielle Lyse) eine positive Identifikation der bakteriellen Ziel. Obwohl diese Tests robust sind, leiden sie unter drei Mängel: 1) sie sind im Labor basiert, 2) die sie benötigen bakterielle Isolierung und Kultivierung von den verdächtigen Probe, und 3) nehmen sie 24-36 h in Anspruch nehmen. Um diese Probleme anzugehen, wurden rekombinante "light-Tag"-Reporter Phagen genetisch durch die Integration der Vibrio harveyi luxAB Gene in das Genom von Y. entwickelt pestis und B. anthracis spezifische Phagen ^5-8. Die daraus resultierende luxAB Reporter Phagen konnten ihre spezifische Ziel von schnell zu erkennen (in Minuten) und sensibel Übertragung einer Biolumineszenz Phänotyp an den Empfänger-Zellen. Wichtig ist, war die Detektion entweder mit kultivierten Zellen oder Empfänger mit Mock-infizierte klinische Proben ⁷ erhalten.

Zu Demonstrationszwecken hier beschreiben wir das Verfahren für die Phagen-vermittelte Erkennung eines bekannten Y. pestis isolieren mit einem luxAB Reporter Phagen von der CDC Pest diagnostische Phagen ΦA1122 ^6,7 (Abb. 1) konstruiert. Eine ähnliche Methode, mit geringfügigen Änderungen (zB Änderung des Wachstums Temperatur und Medien), kann für den Nachweis von B. verwendet werden anthracis-Isolate mit der B. anthracis Reporter Phagen Wβ: luxAB ^8. Die Methode beschreibt die Phagen-vermittelte Transduktion eines biolumescent Phänotyp angebaut Y. pestis Zellen, die anschließend gemessen werden mit einem Mikrotiterplatten-Luminometer. Die wesentlichen Vorteile dieser Methode gegenüber der traditionellen Phagen Lyse-Assays ist die einfache Handhabung, die schnelle Ergebnisse, und die Möglichkeit, mehrere Proben gleichzeitig Test in einer 96-well Mikrotiterplatten-Format.

Abbildung 1. Erkennung schematisch. Die Phagen werden mit der Probe vermischt, infiziert der Phage die Zelle, luxAB ausgedrückt sind, und die Zelle bioluminesces. Probenvorbereitung ist nicht notwendig, die Phagen und Zellen vermischt und anschließend für Licht gemessen.

Protokoll

1. Y. pestis Platte Impfung

1. Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) Stammkulturen auf Luria-Bertani (LB)-Agar (Miller). Verwenden Sie sterile Technik und erfüllen alle Y. pestis Manipulationen in einer Klasse-II-Typ A Biosicherheitswerkbank. Y. pestis A1122 ist ein Biosafety Level (BSL) 2 ausgeschlossen wählen Agent Belastung. Es fehlt sowohl die 75 kb Paar Low-Calcium-Reaktion (LCR) Virulenzplasmid und pgm locus, dass für die Virulenz erforderlich sind. Wachsen Sie Y. pestis bei 28 ° C für 48 h in einer statischen temperaturgeregelten Luft Inkubator. Die Wachstumsrate von Y. pestis ist la....

Diskussion

Diese Methode zeigt die Fähigkeit des Reporters Phagen schnell erkennen Y. pestis, da die Reporter Phagen können transduzieren eines Biolumineszenz-Signal Antwort auf kultivierten Y. pestis-Zellen innerhalb von 20 min nach dem Phagen hinaus. Der Reporter Phagen ist auch in der Lage direkt nachzuweisen Y. pestis in klinischen Matrizen, ohne die Voraussetzung der Isolation und der anschließende Kultivierung ^7. Im Vergleich zu den Standard-Phagen-Lyse-Assays die in der Regel 48 h für d.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Difco LB-Agar, Miller	VWR	90003-346
Difco LB Brühe, Miller	VWR	90003-350
17 x 100 mm Kulturröhrchen	USA Scientific	1485-0810
n-Decanal	Sigma	D7384
Veritas Mikroplatten-Luminometer	Turner Biosystems	9100-001
Microlite Mikrotiterplatten 96-Well-Platte	VWR	62402-984