Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.
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Methodenartikel
Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung Gehirn infiltrieren Leukozyten (Bils) von Mäusen. Wir zeigen, wie man Mäuse mit Mäuse-Enzephalomyelitis Theiler ist Virus (TMEV) infizieren über eine schnelle intrakraniellen Injektionstechnik und wie man eine Leukocyten-angereicherte Population von infiltrierenden Zellen aus ganzen Gehirn zu reinigen. Kurz gesagt, werden die Mäuse mit Isofluran in einer geschlossenen Kammer und sind frei Hand injiziert mit einer Hamilton-Spritze in den frontalen Kortex. Mäuse werden dann zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion mit Isofluran Überdosierung und ganze Gehirn getötet werden extrahiert und in RPMI homogenisiert mit einem Tenbroeck Gewebe Mahlwerk. Hirnhomogenaten werden durch eine kontinuierliche 30% Percoll-Gradienten zentrifugiert, um das Myelin und andere Zelltrümmer zu entfernen. Die Zellsuspension wird dann bei 40 um angespannt, gewaschen und zentrifugiert auf eine diskontinuierliche Ficoll-Paque Plus-Gradienten zu wählen und reinigen die Leukozyten. Die Leukozyten werden dann gewaschen und in entsprechenden Puffern für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie. Durchflusszytometrie zeigt eine Bevölkerung von angeborenen Immunzellen in den frühen Stadien der Infektion in C57BL / 6 Mäusen. Nach 24 Stunden nach der Infektion, werden mehrere Untergruppen von Immunzellen in der Bils, mit einer angereicherten Population von Gr1 +, CD11b + und F4/80 + Zellen. Daher ist diese Methode zur Charakterisierung der Immunantwort auf eine akute Infektion in das Gehirn.
Protokoll
1. Intrakranielle Virus Injektion:
Das folgende Verfahren wurde geändert und weitgehend durch unser Labor und Kollegen genutzt. Kurz gesagt, intrakranieller Injektion des Daniel Stamm murinen Enzephalomyelitis Theiler ist Virus (TMEV) oder schein-Infektion (1, 10) ist auf junge Mäuse (vorzugsweise 5-6 Wochen alt) durchgeführt, um Gehirn infiltrieren Leukozyten (Bils) zu entlocken. Bitte beachten Sie, dass die Ergebnisse wird zwischen den Daniel Stamm, die Bean-Stamm, und der GDVII Belastung unterscheiden. Für die Zwecke der Ernte Bils, erhalten Mäusen 2x10 5 PFU von TMEV und sind für 24 Stunden infiziert.
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Diskussion
Wir verwenden routinemäßig Durchflusszytometrie, um sowohl die Qualität des Gehirns infiltriert Zellpräparation zu bestimmen und verschiedene Populationen von Immunzellen 2, 9 zu unterscheiden. Bei akuten Zeit-Punkte, ergibt unsere Bils Methode ein hoher Prozentsatz der inflammatorischen Monozyten in der CD45hi Bevölkerung sowie ein hoher Prozentsatz der Makrophagen in der CD45lo Bevölkerung. Dies deutet darauf hin, dass eine reproduzierbare Immunantwort im Gehirn robust können mit unserer Methode charakteris.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Grant NS64571 aus dem NINDS (CLH) unterstützt wird, durch eine frühzeitige Career Development Award von der Mayo Clinic (CLH), und durch ein großzügiges Geschenk von Donald und Frances Herdrich (CLH). Wir möchten die Mayo Clinic Durchflusszytometrie Core for Unterstützung danken.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagens | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| TMEV | Howe Lab | N / A | |
| Daniel Stamm | Invitrogen | 21063-029 | |
| Isofluran | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Rundboden-Oak Ridge Zentrifugenröhrchen | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus- | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypanblau 0,4% (w / v) | Mediatech | 25 bis 900-CI | |
| 15 ml konische Röhrchen | BD Falcon | 352097 | |
| 7 ml Glas Pyrex Marke Tenbroeck Gewebe grinder | Fischer | 08 bis 414-10B | |
| 40 um Zellsieb | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml konischen | BD Falcon | 352070 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma | A9647 | |
| Natriumazid | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21 bis 040-CV | |
| FACS-Röhrchen | BD Falcon | 352054 | |
| Rinderfötenserum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 Hybridom | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-Bodenplatte | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R Zentrifuge oder eine gleichwertige | Beckman | N / A | |
| 96-Well-Platte Eimer und Rotor | Beckman | S2096 | |
| Festwinkelrotor | Beckman | F0360 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N / A | |
| FlowJo 7,5 | Baum Star, Inc. | N / A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | Klon: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C / G) | BD Biosciences | 553128 | Klon: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | Klon: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | Klon: BM8 |
Referenzen
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein,....
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Nachdrucke und Genehmigungen
