Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

Summary

Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode für die Identifizierung der Quelle der fäkale / Urin Kontamination oder Verunreinigung durch Nitrat in Wasser mittels qPCR für die spezifische Quantifizierung von Mensch / Schwein / Rind DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren als MST-Tools vorgeschlagen.

Abstract

Mikrobielle Kontamination der Umwelt stellt eine erhebliche Gesundheitsgefahr. Klassische bakterielle fäkalen Indikatoren haben gezeigt, dass erhebliche Einschränkungen haben, sind Viren resistenter gegen viele Inaktivierung Prozesse und Standards fäkalen Indikatoren nicht auf die Quelle der Verunreinigung zu informieren. Die Entwicklung von kosteneffizienten Methoden für die Konzentration der Viren aus dem Wasser und molekularen Assays ermöglicht die Anwendbarkeit von Viren als Indikatoren für fäkale Verunreinigungen und mikrobiellen Quelle Tracking (MST)-Tools. Adenoviren und Polyomaviren sind DNA-Viren infizieren bestimmten Wirbeltierarten einschließlich des Menschen und werden dauerhaft in Kot und / oder Urin in allen geografischen Gebieten studiert ausgeschieden. In früheren Studien, schlugen wir die Quantifizierung von humanen Adenoviren (HAdV) und JC Polyomaviren (JCPyV) durch quantitative PCR (qPCR) als Index für die menschliche fäkale Verunreinigungen. Vor kurzem haben wir qPCR-Assays für die spezifische Quantifizierung von por entwickeltcine Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV) als tierische Fäkalien Marker der Kontamination mit Empfindlichkeiten von 1-10 Genom Kopien pro Reagenzglas. In dieser Studie stellen wir die Verfahren, nach dem die Quelle der Kontamination in Wasserproben mit diesen Tools zu identifizieren. Als Beispiel für repräsentative Ergebnisse, ist die Analyse der Viren im Grundwasser stellt ein hohes Maß an Nitraten gezeigt.

Nachweis von Viren in niedrig oder mäßig verschmutztes Wasser erfordert die Konzentration der Viren von mindestens mehrere Liter Wasser in einem viel kleineren Volumen, ein Verfahren, das in der Regel umfasst zwei Schritte Konzentration in Serie. Diese etwas umständliche Prozedur und die Variabilität der viralen Erholungen zu beobachten wesentlich erschweren die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Wasserproben.

Zur Beseitigung des Engpasses durch die Zwei-Schritt-Verfahren verursacht haben wir in einem Schritt-Protokoll in den vergangenen studie entwickelt beantragt haben,s und für eine Vielfalt von Wasser-Matrizen. Das Verfahren umfasst: Versauerung der Zehn-Liter-Wasser-Proben, Flockung von Magermilch, Schwerkraftsedimentation der geflockten Materialien, Sammlung des Niederschlags und Zentrifugation, Resuspension des Niederschlags in 10 ml Phosphat-Puffer. Die virale Konzentrat wird für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren und die spezifischen Adenoviren und Polyomaviren von Interesse sind, durch qPCR quantifiziert werden. Hohe Anzahl von Proben können gleichzeitig analysiert werden mit dieser Low-Cost-Konzentration Methode.

Das Verfahren ist auf die Analyse von Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser angewendet, und bei dieser Studie präsentieren wir Ergebnisse der Analyse Grundwasserproben. Diese High-Throughput-quantitative Methode ist zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig.

Protocol

1. Die Konzentration der viralen Partikel in Wasserproben

1. Sammlung und Aufbereitung von Wässern
   1. Sammeln Sie mindestens 2 Wiederholungen von 10 L pro Probe in Kunststoff-Behälter mit flachem Boden und einer zusätzlichen Probe als einen Prozess zu steuern. Diese letzte Probe wird mit einer bekannten Menge von Viruspartikeln versetzt werden und als eine Kontrolle.
      Hinweis: Es wird empfohlen, spezielle getrennte Material (Flaschen, Rohre, etc.) für die aufgestockten Proben haben.
   2. Überprüfen Sie die Kalibrierung des Leitfähigkeitsmesser und neu kalibrieren, wenn nötig. Bereiten Sie eine negative Kontrolle mit Leitungswasser vorher auf di....

Discussion

Die beschriebene Vorgehensweise würde die Voraussetzungen für eine passende Methode für den Routineeinsatz Umwelt und öffentliche Gesundheit Laboratorien: reproduzierbar, zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig. Das Protokoll ist einfach, aber es müssen unbedingt beachtet werden. Niedrige Leitfähigkeit in den Proben ohne Zugabe von der angeforderten Konzentration von künstlichem Meerwasser Salze würden drastisch reduzieren die Wiederherstellung von Viren wie der Fall wäre, wenn die Rührzeit zur Flockung deutl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
High-Speed-Zentrifuge (8.000 xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
pH-Meter, Thermometer und Konduktometer	Afora	LPPC3003
Kunststoffrohre 100-200 cm Länge	Deltalab	350059
Sterile absolvierte Einwegpipetten	Labclinics	PN10E1
Sterile Plastikröhrchen von 1,5 und 10-15 ml (Eppendorf, Falken, etc.)	Afora	KA298/00
Centrifuge Töpfe (500 mL)	Fisher Scientific	SE5753512
Magnetrührer und Magneten (eine proProbe)	Fisher Scientific	10510
Glas-oder Kunststoffbehältern mit flachem Boden, die Nutzung der Magnetrührer ermöglichen	Deltalab	191642
Eine peristaltische Pumpe zum Entfernen des Überstandes (oder ein Wasser-Strahl-Vakuumpumpe)	Watson-Marlow	323E / D
Timer zum Abschalten des Rühren nach 8-10 Stunden	Deltalab	900400
Salzsäure (1 N und 0,1 N)	Panreac	141020.1611
Natriumhydroxid (1 N)	Panreac	131687.1211
Künstlichem Meerwasser Meersalz	Sigma	S9883
Magermilch (SM)	Difco	232100
Phosphatpuffer pH 7, 5			1:2 v / v steriler Na 2 HPO 4 0,2 M NaH 2 PO 4 0,2 M bei pH 7,5
Thiosulfat	Panreac	121879.1209	Machen Sie eine 10% ige Lösung in Wasser
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
96-Well-optische Reaktion Platte (500 Einheiten)	Applied Biosystems	43426659
Optische Abdecktüchern (100 Einheiten)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x	Applied Biosystems	4396838