Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

Zusammenfassung

Eine kürzlich entwickelte neuartige Partikelagglutinations (PA)-Assay unter Verwendung von Virus-Rezeptor-Molekül erlaubt eine schnelle und einfache Identifizierung des Poliovirus (PV). In diesem Artikel werden wir das Verfahren für die PA-Assay für PV ausweisen.

Zusammenfassung

In der Global Polio Eradication Initiative spielt Labordiagnostik eine entscheidende Rolle durch die Isolierung und Identifizierung von PV aus der Stuhlproben von akuten schlaffen Lähmungen (AFP) Fällen. In der World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV Isolierung und Identifizierung werden derzeit durch Zellkultur-System und real-time RT-PCR bzw. durchgeführt. In der post-Eradikation Ära der PV, wäre eine einfache und schnelle Identifizierung Verfahren hilfreich sein für die schnelle Bestätigung der Polio-Fälle auf der nationalen Laboratorien. In der vorliegenden Studie zeigen wir das Verfahren von neuen PA-Assay für PV Identifikation entwickelt. Das PA-Assay nutzt Zusammenspiel von PV-Rezeptor-(PVR)-Molekül und Virion, dass bestimmte und einheitliche Affinität zu allen Serotypen von PV ist. Das Verfahren ist einfach (eine Schritt-Verfahren in Reaktion Platten) und schnelle (Ergebnisse können innerhalb von 2 h Reaktionszeit erhalten werden), und das Ergebnis wird visuell beobachtet (Beobachtung der Agglutination von Gelatine-Partikel).

Protokoll

1. Vorbereitung der Wartung Medium (MM) und Wachstumsmedium (GM)

Für die Herstellung von MM und GM finden Sie auf einer Polio-Labor Handbuch des WHO ^1. Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 2% fetalem Kälberserum (FCS) und 10% FCS als Ersatz von MM und GM verwendet werden könnten, bzw. ergänzt.

2. Herstellung von anti-PV-Antikörper

1. Rekonstituieren anti-PV-Antikörper (RIVM PV Eingabe Antiserum) durch Zugabe von Wasser (0,5 ml pro Flasche) zu jeder Flasche des Anti-PV-Antikörper (Typ 1, 2 oder 3). Fügen Sie diese rekonstituierte Antikörper-Lösungen (0,5 ml) auf 4,5 mL MM in separaten beschrifteten Röhrchen.
   Hinweis: Einige viele anti-PV-Antikörper werden als gebrauchsfertige Form (0,5 ml pro Flasche) zur Verfügung gestellt. Für eine solche Menge von anti-PV-Antikörper, ist der Zusatz von Wasser für die Zubereitung nicht erforderlich.
2. Mix gleichen Volumen der rekonstituierten Anti-PV-Antikörper. Für anti-PV1 +2, 2 +3 oder 3 +1: Mix 1,8 ml jedes rekonstituierte Antikörper (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml für jede Mischung). Für anti-PV1 +2 +3: Mix 1,2 ml jedes rekonstituierte Antikörper (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 mL).
   Hinweis: PV-Proben konnte ein Gemisch aus verschiedenen Serotypen von PV enthalten. Um einen Serotyp der PV in Proben mit einer Mischung aus PVs zu identifizieren, ist Pools von anti-PV-Antikörper (dh 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) notwendig.
3. Add 1 / 5 Volumen von FCS (0,72 ml) in jede anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1 oder 1 +2 +3) Antikörper (3,6 mL) (final 18,2% FCS).
   Hinweis: Der Zusatz von FCS ist zur Reduzierung von unspezifischen Agglutination von Gelatine Partikel durch Antikörper verursacht.
4. Halten Sie die Antikörper-Pools bei -20 ° C bis zur Verwendung in PA Assay.

3. Rekonstitution der sensibilisierten Gelatine Teilchen

1. Fügen Sie 1,5 ml Rekonstitutionspuffer im Kit mit einem Fläschchen sensibilisiert Gelatine-Teilchen (sofern als gefriergetrocknetes Pulver) enthalten.
2. Gut mischen durch leichtes Klopfen
3. Halten Sie die rekonstituierte sensibilisiert Partikel bei 4 ° C. Rekonstituierte Gelatine Teilchens sein könnte aktiven mindestens 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt, sollte aber kurz vor dem Test vorbereitet werden.

Wichtiger Hinweis:
Mischen Sie keine unterschiedlichen viel sensibilisierter Gelatinepartikel, weil die Nicht-Agglutination Bild sensibilisiert Gelatinepartikel anders sein könnte, indem die Menge der Teilchen. Für jedes Experiment, soll eine einzige Menge sensibilisiert Gelatine Partikel verwendet werden.

4. PA-Assay für PV Identifikation

1. Bereiten Sie eine Mikrotiterplatte. Zur Identifizierung eines Virus-Probe, wir brauchen 5 Brunnen + mindestens eine negative Kontrolle (sensibilisiert Teilchen ohne Virus und Antikörper, sowie Nr. 6 in unten. See No Virus und Antikörper-Steuerung im Beispiel). Anzahl der Bohrungen beträgt 5 x Proben + mindestens eine Kontrolle in dem Test.
   Wichtiger Hinweis:
   Bitte nehmen Sie sich mindestens eine No-Virus und Antikörper-Kontrolle in den Test. Eine Durchstechflasche sensibilisiert Teilchen ist etwa für die Identifizierung von 10 Virusproben.
2. Add 12 ul / well anti-PV-Antikörper oder GM, die Mikrotiterplatte. Die Anordnung der Platte ist wie folgt (siehe auch Beispiel unten). In Proben ohne Antikörper (auch Nr. 1 und 6), fügen Sie 12 ul GM anstelle von anti-PV-Antikörper.
   Wichtiger Hinweis:
   Wenn viele PV-Proben in diesem Test geprüft werden sollte, würde Mehrkanal-Pipetten-oder Dispenser hilfreich sein für diesen Schritt.

   Nun # 1	Nun # 2	Nun # 3	Nun # 4	Nun # 5	Nun # 6
   GM	Anti-P1 +2 +3	Anti-P1 +2	Anti-P2 3	ani-T1 +3	GM

3. Add 12 ul / well des Virus Probe. In einer Probe ohne Virus (auch # 6), fügen Sie 12 ul GM anstelle von Virus-Lösung.
   Hinweis: Virus Probe Kulturüberstand der infizierten Zellen, in der Regel L20B Zellen oder RD-Zellen.
   Wichtiger Hinweis:
   Wenn viele PV-Proben in diesem Test geprüft werden sollte, würde Mehrkanalpipette hilfreich sein für diesen Schritt.

   Nun # 1	Nun # 2	Nun # 3	Nun # 4	Nun # 5	Nun # 6
   Virenprobe	Virenprobe	Virenprobe	Virenprobe	Virenprobe	GM

4. Nehmen Sie rekonstituierte sensibilisiert Partikel-Lösung von 4 ° C bis Raumtemperatur, und klopfen Sie leicht vollständig aussetzen Partikel.
   Wichtiger Hinweis:
   Nach der vollständigen Suspension der Partikel durch leichtes Klopfen, sollten die Teilchen sofort zu den Platten gegeben werden, bevor die suspendierten Teilchen Niederte und bilden nicht-homogene Lösung.
5. Fügen Sie 25 ul / Vertiefung der sensibilisierten Partikel in jede Vertiefung.
   Wichtiger Hinweis:
   Nach Zugabe von sensibilisierten Partikel, sollte die Platte sofort auf Platte Mischen unterzogen werden, um eine einheitliche Reaktion der Proben beginnen. Deshalb sollte neben der sensibilisierten Partikel durch Spender zu einer zeitlichen Verzögerung zwischen den Proben in der Platte zu minimieren durchgeführt werden.
6. Legen Sie die Mikrotiterplatte auf einen Teller Mixer und mischen die Platte für 30 Sekunden.
7. Legen Sie die Mikrotiterplatte auf weißem Papier (zur Erleichterung der visuellen Beobachtung) auf einem Tisch bei Raumtemperatur (15 ~ 30 ° C) für 2 h.
   Wichtiger Hinweis:
   Bewegen Sie sich nicht die Platte, während und nach der Reaktion für die Beobachtung der Ergebnisse und Fotos zu machen. Die gebildeten Agglutination ist nicht stabil und einfach durch Verschieben der Platten gestört.
8. Machen Sie Fotos von der Platte.
   Wichtiger Hinweis:
   Teilansicht des Fotos konnte nicht genügend Daten für eine spätere Untersuchung und Überprüfung der Ergebnisse für die Interpretation. Mehrere Fotos zu ergreifen, um all die Vertiefungen der Platten mit Schwerpunkt auf die Agglutination Bild der Brunnen decken.

5. Die Interpretation der Ergebnisse

1. Identifikation von positiven und negativen Brunnen. Vergleichen Sie die Agglutination in den Proben mit der No-Virus und Antikörper-Kontrolle (Fällung von Gelatine Partikeln, nicht-Agglutination) (Abbildung 1 und 2). Bilder der Agglutination, die eindeutig aus kein Virus und keine Antikörper-Steuerung (non-Agglutination, Negativ-Kontrolle) unterschieden werden sollte als positiv beurteilt werden, und Bilder von Agglutination, die ähnlich wie die negative Kontrolle sind als negativ beurteilt werden. Proben, die klar, aber nur teilweise Agglutination zeigen könnte als positive, aber die Aufnahme als "positiv (Teil-Agglutination)" beurteilt werden.
2. Identifikation von PV. Interpretieren Sie die Ergebnisse auf positive und negative Brunnen mit anti-PV-Antikörper gegen PV-Serotypen identifizieren. Prinzip der Interpretation des Ergebnisses ist ähnlich dem der Neutralisationstest in Zellkultur-System (zB positiv für anti-P1 +2 Antikörper zeigt, dass die Probe vom Typ 3 PV enthält).

6. Repräsentative Ergebnisse

Repräsentatives Ergebnis von PA Assay PV Identifikation ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle PV-Stämme gebildet Agglutination der sensibilisierten Gelatine-Partikel (keine Antikörper-Proben). In Anwesenheit von entsprechenden anti-PV-Antikörper, Fällung von Gelatine-Partikel (non-Agglutination) ähnlich kein Virus und keine Antikörper-Steuerung (negative Kontrolle) beobachtet wurde (z. B. PV1 (Sabin) in Gegenwart von anti-P1 +2 oder anti-P3 1-Antikörper).

Abbildung 1. Identifikation von PV durch PA Assay. Virus-Lösungen von PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) und PV3 (Sabin) (Virustiter von 1,2 x 10 ⁸ CCID ₅₀ / 12 ul, 8,2 x 10 ⁷ CCID ₅₀ / 12 ul, und 3,5 x 10 ⁷ CCID ₅₀ / 12 ul,), wurden für die Identifizierung von PA-Assay verwendet. Kein Virus und keine Antikörper-Kontrolle zeigte Fällung von Gelatine-Partikel (non-Agglutination, Negativ-Kontrolle).

Abbildung 2. Die Interpretation der Positive and Negative Brunnen. Virus-Lösungen von PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) und PV3 (Sabin) (Virustiter von 2,4 x 10 ⁸ CCID ₅₀ / 25 ul, 1,7 x 10 ⁸ CCID ₅₀ / 25 ul, und 7,3 x 10 ⁷ CCID ₅₀ / 25 ul bezeichnet) wurden verdünnt 1 / 20 bis 1 / 320 und dann 25 ul der verdünnten Proben wurden durch PA-Assay ohne Anti-PV-Antikörper untersucht.

Diskussion

Die einzigartige Punkt dieser PA-Assay ist die Nutzung von PVR-Molekül statt Anti-PV-Antikörper für den Nachweis von PV 2. Dies ermöglicht eine spezifische Wechselwirkung der sensibilisierten Gelatinepartikel mit PV mit einer einheitlichen Affinität zu allen drei Serotypen des PV ^3-6. Wir benutzten einen Immunoadhäsin Form von PVR (PVR-IgG2a) für die Sensibilisierung der Gelatine Partikeln, weil monomeren Formen der PVR nur moderate Affinitäten zu den einzelnen Bindungsstelle am Virion (Dissoziationskonstante...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Sensibilisiert-Gelatine-Partikel	Fujirebio Inc.		Test-Kit
Rekonstitutionspuffer	Fujirebio Inc.		Test-Kit
Mikrotiterplatte	Fujirebio Inc.		Test-Kit
Anti-PV-Antikörper	RIVM