Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Zusammenfassung

Testen Protein-Protein-Interaktion ist für die Präparation von Protein-Funktionalität unverzichtbar. Hier stellen wir eine In-vitro- Protein-Protein-Bindungs-Assay auf eine Membran-immobilisierten Protein mit ein lösliches Protein-Sonde. Dieser Test liefert eine zuverlässige Methode, um die Interaktion zwischen einem unlöslichen Protein und ein Protein in Lösung zu testen.

Zusammenfassung

Validating Interaktionen zwischen verschiedenen Proteinen ist von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen auf molekularer Ebene. Es gibt mehrere Methoden, sowohl in vitro und in vivo, um Protein-Bindung zu bewerten, und mindestens zwei Methoden, die die Mängel der einander ergänzen sollten durchgeführt werden, um zuverlässige Erkenntnisse zu erhalten.

Für eine in vivo-Assay, der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC)-Assay die beliebteste und am wenigsten invasive Ansatz, um Protein-Protein Interaktion in lebenden Zellen erkennen kann ist, zu identifizieren sowie die intrazelluläre Lokalisation der wechselwirkenden Proteinen ^1,2. In diesem Test nicht-fluoreszierenden N-und C-terminalen Hälften von GFP oder seinen Varianten zu testen Proteine ​​fusioniert sind, und wenn die beiden Fusionsproteine ​​zusammen sind aufgrund der getesteten Proteine ​​Interaktionen gebracht wird, wird das Fluoreszenzsignal ^3-6 rekonstituierte . Da das Signal ist leicht nachweisbar durch Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie hat BIFC als ein mächtiges Werkzeug der Wahl unter Zellbiologen zur Untersuchung über Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen ³ entstanden. Dieser Test kann jedoch manchmal zu falschen positiven Ergebnissen. Zum Beispiel kann das Fluoreszenzsignal durch zwei GFP-Fragmenten so weit wie 7 nm von einander durch so angeordnet, dass eine dichte Packung in einem kleinen subzellulären Kompartiment aufgelöst werden, sondern dass aufgrund der spezifischen Wechselwirkungen ^7.

Aufgrund dieser Einschränkungen sollten die Ergebnisse von Live Cell Imaging-Technologien erhalten von einem unabhängigen Ansatz, der auf einem anderen Prinzip zur Detektion von Protein-Interaktionen bestätigt werden. Co-Immunpräzipitation (Co-IP) oder Glutathion-Transferase (GST) Pull-down-Assays stellen solche alternative Methoden, die häufig verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen in vitro zu analysieren. Allerdings bBei diesen Tests müssen jedoch die getesteten Proteine ​​werden leicht löslich in den Puffer, der für die Bindungsreaktion supportsused. Daher können keine speziellen Wechselwirkungen zwischen einem unlöslichen Protein nicht durch diese Techniken bewertet werden.

Hier zeigen wir Ihnen das Protokoll für die Protein-Membran-Overlay-Bindungs-Assay, die diese Schwierigkeit umgeht. Bei dieser Technik kann die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen zuverlässig geprüft werden, weil eines der Proteine ​​auf eine Membran-Matrix immobilisiert ist. Diese Methode, die in Kombination mit in vivo-Experimente, wie BIFC, bietet eine zuverlässige Methode zu untersuchen und zu charakterisieren Interaktionen treu zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen. In diesem Artikel Bindung zwischen Tabak-Mosaik-Virus (TMV) Bewegung Protein (MP), die mehrere Funktionen ausübt während virale Zelle zu Zelle transportieren ^8-14, und eine vor kurzem identifizierte Pflanze zellulären interactor, Tabak Ankyrin repeat-containing protein (ANK ) ^15, wird gezeigt, mit dieser Technik.

Protokoll

1. Expression und Extraktion der Proteine

1. Unterschiedlich tag die Proteine ​​für ihre Erkennung getestet werden. Beschriften Sie die Protein auf der Membran (ProIM) mit einem Tag einer größeren Größe (zB GST) immobilisiert werden und die nicht kondensierten Tag kann als ein immobilisiertes negative Kontrolle (ProIMnc) verwendet werden. Beschriften Sie die Protein als löslich Sonde (PROSOL) entweder mit einem großen oder einem kleinen Etikett verwendet werden. Sicherung der gleichen Tag, um eine negative Kontrolle lösliches Protein (ProSOLnc) und beinhalten in der Interaktion Test, um die Spezifität der nachgewiesenen Bindung zu bestätigen.
2. Wählen Sie die Protein-Expression System tagged Proteine ​​zu exprimieren, dh E. coli, Baculovirus, etc., je nach Anforderung für potenzielle posttranslationalen Modifikationen und Renditen der Proteine.
3. Auszug ProIM und ProIM _nc aus dem Organismus der Wahl (Schritt 1,2) mit SDS-PAGE-Ladepuffer (20% Glycerin, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH 6,8) mit Proteinase-Inhibitor-Cocktail. Verlassen Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 15 min, mit 0,5% 2-Mercaptoethanol und kochen für 5 min.
4. Auszug PROSOL und PROSOL _nc aus dem Organismus der Wahl (Schritt 1,2) mit einem Standard-Protokolle ^16. Diese Proteine ​​werden sollte leicht löslich in Bindungspuffer (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% BSA, 0,1% Tween 20) verwendet in den Schritt 4.1.
5. Bestimmen Sie die Konzentration der rekombinanten Proteine ​​mit einem Standard-Verfahren, wie zB Bio-Rad Protein Assay Kit. wie Bio-Rad Protein Assay Kit. Wenn Rohextrakt, anstatt gereinigtes Protein, für den Assay verwendet wird, schätzen die Konzentration des Proteins von Interesse in diesem Extrakt durch Scannen Densitometrie der entsprechenden Band auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit Coomassie Brilliant Blue R-250 und mit bekannten Konzentrationen von BSA als Referenz.

2. Immobilisierung von ProIM und ProIMnc auf der Membran

1. Resolve zwei Sätze von Extrakten, die jeweils 1 pg ProIM und ProIM _nc auf einem SDS-Polyacrylamidgel nach dem Standardprotokoll ^16.
2. Nach der Elektrophorese, platzieren Sie den Transfer des Gels in 100 ml Transferpuffer (60 mM Glycin, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) und inkubieren unter leichtem Schütteln für 20 min bei Raumtemperatur.
3. Elektrotransfer die Proteine ​​in dem Gel auf eine Nitrozellulose-Membran enthielt nach dem Standardprotokoll ^16.

3. Re-Faltung von Membran-gebundenen Proteine

1. Nach Elektrotransfer, inkubieren Sie die Membran für 15 min in 15 ml Puffer A (30 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,05% Tween 20) unter leichtem Schütteln, um restliches SDS zu entfernen.
2. Nach dem Ablassen sorgfältig, übertragen Sie die Membran in 25 ml Denaturierungspuffer (7 M Guanidin-Hydrochlorid, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). und für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. (Hinweis: Die Nitrozellulosemembran wird undurchsichtig, wenn in der Denaturierung Puffer). und für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
3. Übertragen Sie die Membran in 25 ml TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) und Inkubation unter leichtem Schütteln für 5 min (Anmerkung: In diesem Schritt gewinnt die Membran ihre ursprüngliche weiße Farbe).
4. Übertragen Sie die Membran in 25 ml Bindungspuffer (siehe Schritt 1.2) und inkubieren Sie bei 4 ° C unter leichtem Schütteln über Nacht.

4. Probing the ProIM durch PROSOL

1. Schneiden Sie die Membran in zwei Streifen, die beide mit ProIM und ProIM _nc.
2. Machen Sie den PROSOL und ProSOLnc Hybridisierung durch Verdünnung der Vorbereitung mit 1-10 ug entweder PROSOL oder ProSOLnc in 10 ml frisches Bindungspuffer. Übertragen Sie jede Membran in die PROSOL oder ProSOLnc Hybridisierungslösung und Inkubation für 1,5 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
3. Entfernen Sie die Membranen, die aus der Hybridisierung Lösungen und spülen dreimal für je 15 min in TBS.

5. Visualisierung von Protein-Protein-Interaktion durch Immunoblot

1. Blockieren Sie die Membran mit 2,5% Magermilch in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) für 1 h bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die primären Antikörper (Anti-strepII polyklonale Kaninchen-Antikörper) in 0,5% Magermilch in TBST bei der Konzentration der vom Hersteller empfohlen.
2. Legen Sie die verstopfte Membranen in der Antikörper-Lösung, und für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
3. Spülen Sie die Membranen in 20 ml TBST für 15 min und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
4. Verdünnen Sie die Sekundär-Antikörper (Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper) konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) in 0,5% Magermilch in TBST bei der Konzentration der vom Hersteller empfohlen. Legen Sie die Membranen in der Sekundär-AntikörperLösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
5. Spülen Sie die Membranen in 20 ml TBST für 15 min und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Nach dem letzten in TBS spülen, visualisieren die Protein-Protein Interaktion mit einem HRP Chemilumineszenz Substrat (z. B. Millipore Immobilon westlichen Chemilumineszenz HRP Substrat).
6. Probe der gleichen Membranen mit dem primären Antikörper für das Tag fusioniert ProIM, durch die entsprechenden Sekundär-Antikörper wie in den Schritten von 5,1 bis 5,4 beschrieben wird. Visualisieren Sie ProIM und ProIMnc wie beschrieben in Schritt 5,5 bis die Identität des Bands in die Proteinmembran Overlay-Assay (Schritt 5,5) erhalten zu validieren. In den meisten Fällen erfolgt das Ausbrechen nicht notwendig, da das Signal von diesem Schritt erhalten ist viel stärker als Restsignal von Schritt 5,5.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Die ANK-MP-Interaktion wurde durch BIFC in Tabak Epidermiszellen (Abbildung 1A) beobachtet. Da MP ist ein hoch unlösliche Proteinablagerungen, wenn in Bakterien oder in Pflanzen exprimiert, wurde das Protein-Membran-Overlay-Assay angenommen, um diese Interaktion in vitro (Abbildung 1B) zu validieren. Proteinextrakte mit 1 pg GST-MP (ProIM) oder ungesichert GST (ProIM _nc) wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Elektrotransfer auf eine Nitrozellulosemembran folgte aufgelöst. Wenn diese ProIMs mit löslichen ANK-strepII (PROSOL), GST-MP, aber nicht fusionierten GST wurden sondiert, zeigten Bindung (Abbildung 1B, Bahnen 1, 2, auf den Spuren 5, 6 zu vergleichen). Außerdem, wenn die gleiche Menge von ProIMs mit einem unabhängigen, ProSOLnc, dh Arabidopsis zytoplasmatischen NADH-Kinase markiert strepII (NADH3-strepII), keine Bindung wurde nicht beobachtet wurden sondiert ein weiterer Beweis für die Spezifität der ANK-MP-Wechselwirkung (Abbildung 1B, Bahnen 3, 4).

Abbildung 1. Spezifische Bindung von Tabak ANK zu TMV MP in vivo und in vitro. (A) ANK-MP-Interaktion in lebenden Tabak Epidermiszellen wie BIFC erkannt. Starke YFP-Signal rekonstruiert wurde, wenn MP und ANK, um C-terminal und N-terminalen Hälften von YFP bzw. verschmolzen, wurden in Tabak Epidermis folgenden microbombardment ihrer kodierenden Gene koexprimiert. Diese BIFC Signal in puncta an der Zellperipherie, die Diagnose von Plasmodesmen ¹⁵ sind angesammelt. (B) ANK-MP-Interaktion in vitro durch Protein-Membran-Overlay-Assay nachgewiesen. Proteinextrakte mit 1 pg GST-MP (ProIM) oder ungesichert GST (ProIMnc) wurden auf einem 15% SDS-Polyacrylamidgel von Elektrotransfer auf eine Nitrozellulosemembran folgte aufgelöst. Die GST-MPProIM und GSTProIMnc wurden mit 0,5 ug / ml ANK-strepII (PROSOL) inkubiert und ANK Bindung wurde durch Untersuchung der Membran mit anti-strepII polyklonalen Kaninchen-Antikörper, gefolgt von Anti-Kaninchen-IgG + M konjugierten Sekundärantikörper detektiert HRP (Spuren 1 und 2). Weder GST-MPProIM noch GSTProIMnc mit einem nicht verwandten Proteinen, Arabidopsis zytoplasmatischen NADH-Kinase, fusioniert mit dem strepII tag (ProSOLnc, Bahnen 3 und 4) interagiert. Die Identität der Band in diesem Assay beobachtet wurde durch Untersuchung der Membran mit anti-GST-Antikörper (Spuren 5 und 6) bestätigt. Wenn die Membran mit Denaturierungspuffer wurde, ohne mit Puffer A gewaschen behandelt werden, ist die Bindung des GST-MP zu ANK verloren, während nicht identifizierte Proteine ​​in der GST-MP und GST contining Eiweißextrakte enthaltenen reagierte mit ANK-strepII, zeugt von der Bedeutung der Schritt 3.1 vor der Denaturierung (Spuren 7 und 8).

Diskussion

Dieser Ansatz eignet sich zur Prüfung Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen Kombinationen der Proteine, wenn mindestens eine von denen die Proteine ​​ist leicht löslich in den Bindungspuffer und erfolgreich an andere Kombination von Proteinen ^17,18 aufgebracht. Die iInteractions zwischen den Proteinen, die sowohl unter diesen Bedingungen unlöslich kann nicht durch dieses Protokoll getestet werden.

Auch erfolgreiche Rückfaltung von ProIM kritisch für den Test. Spülen der Membra...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Protein-Assay-Kit	Bio-Rad	500-0001
Proteinase-Inhibitor-Cocktail	SIGMA	S8820
Mini-PROTEAN System	Bio-RAD	165-8000
Semi-dry Western-Blot SD Elektrotransfer System	Bio-RAD	170-3940
Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase	GenScript	A00098
Anti-GST polyklonalen Kaninchen-Antikörper	GenScript	A00097
Anti-strepII	GenScript	A00626
BioTrace, NT Nitrocellulose Transfer Membran	Pall Scientific	27377-000
Immobilon westlichen Chemilumineszenz HRP Substrat	Millipore	WBKL S0 050