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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Erstellen eines PCOS-ähnlichen Mausmodells
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Mäuse hatten einen gemischten Hintergrund (C57/B6, CD1, 129Sv) und wurden ad libitum mit Futter und Wasser in einem 14/10 h Hell-Dunkel-Zyklus bei 24 °C gehalten.
- DHT-Pellet-Vorbereitung
- Autoklavieren Sie silastische Schläuche zum Sterilisieren. Schneide silastische Röhren mit einer Rasierklinge auf eine Länge von 15 mm zu.
- Versiegeln Sie eine Seite, indem Sie medizinisches Klebesilikon mit einer 20 G stumpfen Nadel in die Tube injizieren, die an einer 3-ml-Spritze befestigt ist. Der Kolben sollte aus der Spritze gezogen und dann der Klebstoff in das Reservoir eingeführt werden. Der Kolben wird wieder eingesetzt und der Klebstoff nach unten gedrückt, bis er beginnt, aus der Nadel auszutreten. Die stumpfe Nadel wird hergestellt, indem die scharfe Spitzenseite der 20-G-Nadel mit einer starken Schere abgeschnitten wird. Die Länge des Silikons in der Tube sollte mehr als 2 mm betragen, um das Trimmen nach der Produktion zu ermöglichen.
- Über Nacht trocknen; auf der versiegelten Seite auf Luftblasen prüfen. Für DHT-Pellets werden solche ohne Luftblasen verwendet. Andere können für No-DHT-Kontrollpellets verwendet werden.
- Tragen Sie Handschuhe, Maske, Schutzbrille und Laborkittel, bevor Sie DHT-Pellet in einer Haube herstellen, um einen DHT-Kontakt mit der Haut zu vermeiden.
- Gießen Sie DHT-Pulver in eine Kunststoff-Waage und drücken Sie die offene Seite der selbstklebenden Röhrchen (hergestellt in 1.1.1) in das DHT-Pulver.
- DHT-Pulver kann mit einer großen Büroklammer festgedrückt werden, die gerade gerichtet wird. Fahren Sie fort, bis DHT eine Höhe von 4 mm (oder die gewünschte Länge) erreicht hat. Kontrollieren Sie die Länge des DHT mit einem Lineal und versiegeln Sie die offene Seite mit Silikon, trocknen Sie sie über Nacht.
- Schneiden Sie jede versiegelte Seite so ab, dass die Länge des Silikons 2 mm lang ist. Die Gesamtlänge des Pellets beträgt 8 mm.
- Verschließen Sie beide Seiten des leeren silastischen Schlauchs als Kontrollpellet (ohne DHT).
- Bewahren Sie die Pellets bis zur Verwendung in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf, das mit Folie umwickelt ist (um Lichteinwirkung zu vermeiden). Die DHT-Pellets behalten ihre volle Wirksamkeit für mindestens 3 Monate Lagerung.
- DHT-Einsetzen und -Ersetzen
- Bis zu 20 DHT-Pellets oder Kontrollpellets werden separat in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 30 mL steriler 0,9%iger Kochsalzlösung für 24 Stunden bei 37 °C getaucht, um sie kurz vor dem Einsetzen auszugleichen.
- Vor der Operation werden die Oberflächen und Handschuhe mit Clidox desinfiziert und die Arbeitsflächen mit sauberem, saugfähigem Kunststoffpapier (OP-Pad) abgedeckt. Alle Instrumente, die mit Tieren in Berührung kommen, werden vor dem Betreten der Tierhaltung durch Autoklavieren dekontaminiert. Die Instrumente dürfen vor dem Gebrauch trocknen und abkühlen.
- Es werden 2 Monate alte weibliche Mäuse verwendet (4–5 Mäuse/Käfig). Mäusen werden intraperitoneal Xylazin (3,5 mg/kg KG) und Ketamin (78,8 mg/kg KG) mit einer Insulinspritze injiziert. Die Berechnungen für das Mischen und Dosieren der Anästhesie sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Nachdem eine adäquate Anästhesie erreicht wurde, gemessen am Verlust des Zehenreflexes und verlangsamter Atmung, wird die Maus für die Operation vorbereitet.
- Desinfizieren Sie die Haut der Stelle mit Betadin mit steriler Gaze und reinigen Sie sie mit 70%igem Ethanol. Die Fläche wird wieder mit Betadin gestrichen.
- Schneiden Sie mit einer Schere ein ca. 5 mm langes Loch unter die Haut in der Nähe des Halses. Mit einem 10 G Trochar einen kleinen Tunnel (15 mm) in rostraler Richtung machen. Das Pellet wird dorsal mit dem Trochar eingeführt.
- Anschließend wird die Öffnung mit chirurgischem Kleber versiegelt. Nähern Sie sich den Wundrändern manuell mit einer Pinzette und sanften Bürstenstrichen, um einen dünnen Film aus flüssigem Klebstoff auf die angenäherten Wundränder aufzutragen. Bauen Sie 3 dünne Schichten Klebstoff auf, um sicherzustellen, dass der Kleber gleichmäßig auf der Wunde verteilt wird. Der Kleber sollte auf jeder Seite der anliegenden Wundränder 1 cm reichen. Zum Verschließen des Lochs können auch Naht- oder chirurgische Clips verwendet werden. Setzen Sie die Mäuse zurück in einen Käfig, der einzeln untergebracht ist und zur Erholung mit einem Wärmekissen versehen ist. Ersetzen Sie das Pellet alle 4 Wochen, um eine konstante Androgenbelastung aufrechtzuerhalten. Das ursprüngliche Pellet wird entfernt und das neue Pellet wird wie oben beschrieben in einer ähnlichen Position eingesetzt.
| Ketamin
(100 mg/ml)
| Xylazin
(100 mg/ml)
| salzhaltig
(0,9 %)
|
| 175 μL | 15 μL | 810 μL |
| Intraperitoneale Injektion der Arbeitslösung: 0,1 mL/20 g Körpergewicht |
Tabelle 1. Ketamin/Xylazin-Cocktail.