Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. SE Induktion
- Kaufen Sie 8 Wochen alte männliche C57BL/6NHsd-Mäuse und wiegen Sie jede Maus. Verwenden Sie dann einen Markierungsstift, um die Schwänze aller Mäuse zu markieren, damit sie während der SE-Induktion leicht identifiziert werden können.
- Berechnen Sie die Menge an Scopolaminmethylbromid (Scopolamin; 2 mg/kg), Terbutalin-Hemisulfat (Terbutalin; 2 mg/kg) und Pilocarpinhydrochlorid (Pilocarpin; 280 mg/kg) basierend auf dem Gewicht der Maus und fügen Sie Kochsalzlösung (0,9 % NaCl, 10 ml/kg) hinzu, um Lösungen herzustellen.
HINWEIS: Wenn das Gewicht der Maus beispielsweise 25 g beträgt, werden die folgenden Mengen angewendet: Scopolamin und Terbutalin: 2 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, Kochsalzlösung: 10 ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 ml, Pilocarpin: 280 mg/kg * (25 g/1.000 g) = 7 mg, Kochsalzlösung: 10 ml/kg * (25 g/1.000 g) = 0,25 ml.
- Laden Sie das Scopolamin-Terbutalin-Gemisch in eine 1-ml-Spritze mit einer 30-g-Nadel. Injizieren Sie die Lösung intraperitoneal in jede Maus und bringen Sie die Mäuse dann wieder in ihre Käfige zurück. 30 Minuten nach der Verabreichung von Scopolamin und Terbutalin injizieren Sie Pilocarpin-Lösung in jede Maus (i.p.; 1 ml Spritze; 30 g Nadel). Unmittelbar nach der Injektion von Pilocarpin legen Sie die Mäuse zur Beobachtung in einen Inkubator (28–30 °C).
- Überwachen Sie das Verhalten der Mäuse sorgfältig, bis SE induziert wird. Wenn limbische motorische Anfälle festgestellt werden, die gemäß der Racine-Skala dem Stadium 3 oder höher entsprechen, zeichnen Sie die Zeit auf und überwachen Sie die Mäuse, um festzustellen, ob die Anfälle häufiger auftreten. Sobald kontinuierliche motorische Anfälle länger als 2 Minuten andauern, setzen Sie die Maus in einen neuen Käfig bei Raumtemperatur und überwachen Sie sie 3 Stunden lang, um festzustellen, ob ihre Krampfanfälle anhalten und SE induziert wird. Die Mäuse, die nicht in den SE eingedrungen sind, werden etwa 2 Stunden nach der Pilocarpin-Injektion eingeschläfert.
HINWEIS: Racine-Skala; Stufe 1, Mund- und Gesichtsbewegung; Stufe 2, Kopfnicken; Stadium 3, Klonus der Vordergliedmaßen; Stadium 4, Aufzucht mit Klonus der Vordergliedmaßen; Stadium 5, Auf- und Fallen mit Klonus der Vordergliedmaßen. Wenn die Maus nicht sofort nach der SE-Induktion bei Raumtemperatur in den Käfig überführt wird, kann die Maus an Hyperthermie sterben.
- Beenden Sie verhaltensbedingte akute Anfälle 3 Stunden nach SE-Beginn durch Injektion von Diazepam-Lösung (i.p.; 10 mg/kg; 1 mL Spritze; 30 g Nadel). Zur Herstellung der Diazepam-Lösung wird 5 mg/ml Diazepam in 10%igem Polyoxyl 35 hydriertem Rizinusöl unter Zugabe von Kochsalzlösung (i.p.; 10 ml/kg; 1 mL Spritze; 30 G Nadel) verdünnt.
HINWEIS: 10% Polyoxyl 35 hydrierte Rizinusöllösung: 1 mL Polyoxyl 35 hydrierte Rizinusöllösung + 9 mL Kochsalzlösung. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Wenn das Körpergewicht der Maus beispielsweise 25 g beträgt, injizieren Sie 250 μl Diazepam-Lösung: 50 μl 5 mg/ml Diazepam + 200 μl 10% Polyoxyl 35 hydrierte Rizinusöllösung = 250 μl 1 mg/ml Diazepam.
- Bei Scheinmäusen führen Sie eine i.p. Injektion der Mischung aus Scopolamin Methylbromid und Terbutalin Hemisulfat durch (i.p.; beide 2 mg/kg, 10 ml/kg; 1 mL Spritze; 30 g Nadel). 30 Minuten später injizieren Sie die Kochsalzlösung intraperitoneal (i.p.; 10 mL/kg; 1 mL Spritze; 30 g Nadel).
HINWEIS: Wenn das Körpergewicht der Maus 25 g beträgt, injizieren Sie 250 μl Kochsalzlösung anstelle von Pilocarpin.
- Nach der Diazepam-Injektion (i.p.; 1 ml Spritze; 30 g Nadel) verabreichen Sie 1 ml 5 % Dextrose pro Maus (i.p.; 1 ml Spritze; 26 g Nadel).
HINWEIS: 1 ml 5% Dextrose-Injektion liefert eine Energiequelle und Hydratation, die die Überlebensrate erhöhen kann.
- Wischen Sie während der Nachsorge im Inkubator (28–30 °C) überschüssiges Sekret wie Speichel, Tränen und Kot ab.
- Wiegen Sie die Mäuse am Tag 1 nach der SE-Induktion und bewahren Sie sie einen weiteren Tag lang im Inkubator (28–30 °C) auf. An Tag 2, nach der SE-Induktion, wiegen Sie die Mäuse und bringen Sie sie in ihren Heimkäfig zurück. Stellen Sie feuchtes Futter bereit, um ihre Genesung zu erleichtern.
HINWEIS: In diesem Experiment betrug die Mortalitätsrate für C57BL/6NHsd nach SE-Beendigung durchschnittlich 8,57 % (3 von 35 getesteten Mäusen).
- Messen Sie das tägliche Körpergewicht der Tiere bis 7 Tage nach der Behandlung mit Pilocarpin und injizieren Sie den Mäusen 5 % Dextrose (i.p.; 1 mL Spritze; 26 g Nadel), wenn das Körpergewicht nicht zugenommen hat. Beenden Sie die Überwachung des Körpergewichts, wenn die Mäuse 2 Tage nach der Pilocarpin-Injektion wieder an Körpergewicht zunehmen und ohne Schwierigkeiten feuchtes Futter zu sich nehmen.
HINWEIS: Wenn das Körpergewicht einer Maus erst 7 Tage nach SE zugenommen hat, schließen Sie die Maus aus dem Experiment aus und euthanasieren Sie sie durch Kohlendioxid. Je nach Hintergrund der Maus kann es gelegentlich zum Tod kommen; Im Fall von C57BL/6NHsd starben jedoch weniger als 1 % der Mäuse in diesen Experimenten. Mit einer Überlebensrate von mehr als 7 Tagen nach SE-Induktion sterben die Mäuse während der Latenzzeit selten.
