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Research Article
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Quelle: Wadosky, K. M., et al. Erzeugung von Tumor-Organoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs. J. Vis. Exp. (2019).
Organoide, die von Tumoren abgeleitet werden, sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das die pathologischen Merkmale und die organspezifische Zelllinie von Tumoren beibehalten kann. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Organoide aus einem Prostatatumor aus einem gentechnisch veränderten Mausmodell erzeugen.
Die hier beschriebenen Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York, durchgeführt.
HINWEIS: Männliche Mäuse, die präpariert werden sollen, um Prostata oder Prostatatumoren zur Erzeugung von Organoiden zu isolieren, sollten mindestens das Alter der Geschlechtsreife erreicht haben - etwa 8-10 Wochen alt. Das spezifische Alter von Mäusen kann in den Studien variieren. Zu den Faktoren, die bei der Wahl des Alters zu berücksichtigen sind, gehören altersabhängige Veränderungen in Prostatazellpopulationen, die altersabhängige Expression spezifischer Promotor-gesteuerter Cre-Transgene und die Progressionsrate von Prostatatumoren in einem bestimmten GEMM.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine bildliche Beschreibung des Verfahrens zur Erzeugung von Tumor-Organoiden.
1. Vorbereitung
2. Zerkleinerung und Verdauung von Tumorgewebe
3. Zählen von Zellen und Resuspension in der Matrix
4. Beschichtung von Matrixkalotten und Auftragen von Medien

Abbildung 1: Flussdiagramm des Protokolls zur Generierung von Prostatatumor-Organoiden. Nach dem Präparieren des Prostatatumors wird das Gewebe in 1 mm große Stücke zerkleinert. Verdauen Sie die Tumorstücke in Kollagenase, sammeln Sie die Zellen und verdauen Sie sie in Trypsin, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Nach dem Zählen der Zellen wird die Matrix in einem Volumen resuspendiert, das für eine Zellkonzentration von 1,0 x 106 Zellen/ml erforderlich ist. Kuppeln in der Schale mit einer tropfenweisen Methode anrichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| 0,25 % Trypsin+2,21 mM EDTA | Sigma | Nr. 25-053 | |
| Nr. A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Erweitertes DMEM/F12+++ | Gibco | Artikel-Nr.: 12634 | |
| Analytische Waage | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50-fach) | Gibco | 17504044 | |
| Kollagenase II | Gibco | 17101015 | |
| EHS-Sarkom-Matrix, Pathclear Los#19814A10 | Hergestellt von Trevigen | Requisition vom National Cancer Institute am Frederick National Laboratory | Inhaber von Zuschüssen des National Cancer Institute können eine Matrix beantragen |
| HEPES (1 M) | Sigma | Nr. 25-060 | |
| humaner rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Sigma | Nr. 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cystein | Sigma | Nr. A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | Nr. P4333 | |
| Präzisionswaage | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Einschneidige Carbon-Rasierklinge | Fisherbrand | Tel.: 12-640 | |
| Y-276632 (Gesteins-Inhibitor) | APExBIO | Nr. A3008 |