Herstellung von Organoiden aus Tumoren: Ein 3D-In-vitro-Tumormodell

Die hier beschriebenen Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York, durchgeführt.

HINWEIS: Männliche Mäuse, die präpariert werden sollen, um Prostata oder Prostatatumoren zur Erzeugung von Organoiden zu isolieren, sollten mindestens das Alter der Geschlechtsreife erreicht haben - etwa 8-10 Wochen alt. Das spezifische Alter von Mäusen kann in den Studien variieren. Zu den Faktoren, die bei der Wahl des Alters zu berücksichtigen sind, gehören altersabhängige Veränderungen in Prostatazellpopulationen, die altersabhängige Expression spezifischer Promotor-gesteuerter Cre-Transgene und die Progressionsrate von Prostatatumoren in einem bestimmten GEMM.

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine bildliche Beschreibung des Verfahrens zur Erzeugung von Tumor-Organoiden.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie Organoidmedien für die Prostata der Maus gemäß Drost et al. mit den folgenden Änderungen vor. Verwenden Sie konditioniertes Medium anstelle von rekombinanten Proteinen für Noggin und R-Spondin und verwenden Sie eine Endkonzentration von 1 % (v/v) anstelle von 10 % für Noggin- und R-Spondin-konditioniertes Medium.
   HINWEIS: HEK293-Zellen, die stabil mit HA-Maus Noggin-Fc oder HA-Maus Rspo1-Fc transfiziert wurden, werden zur Herstellung von Noggin- bzw. R-Spondin-konditioniertem Medium verwendet. Diese Zelllinien waren ein Geschenk des Calvin Kuo Labors an der Stanford University.
2. Bereiten Sie die Aufschlusslösung in einem 15-ml-Röhrchen vor, indem Sie 20 mg/ml Kollagenase II mit Advanced DMEM/F12(+++) Medien auf eine Endkonzentration von 5 mg/ml verdünnen. Y-27632 Rock Inhibitor zur Kollagenase II-Lösung in einer Endkonzentration von 10 μM hinzufügen.
   HINWEIS: Das Verhältnis von Verdauungspuffer zu Gewebe beträgt 1 mL zu 50 mg, das wir nach Drost et al. verwenden.

2. Zerkleinerung und Verdauung von Tumorgewebe

1. In die Zellkulturhaube wird Prostatatumorgewebe in eine sterile 10 cm große Kulturschale gegeben, nekrotisches Gewebe präpariert und entsorgt.
2. Zerkleinern Sie das restliche Prostatatumorgewebe in 1 mm³ Würfel, indem Sie die Gewebestücke mit der steril gebogenen Pinzette festhalten und mit einer Dissektionsschere schneiden.
3. Legen Sie die zerkleinerten Tumorstücke in das 15-ml-Röhrchen mit dem Verdauungspuffer, indem Sie sie mit der gebogenen Seite der Pinzette aufschöpfen. Verdauen Sie das Tumorgewebe bei 37 °C unter Schütteln für 1,5 bis 2 h. Kontrolle des Verdauungsfortschritts alle 20 min.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt mindestens 2 mL Matrix aus der Lagerung bei -20 °C entnehmen und auf Eis auftauen. Das Auftauen von 1 ml-Aliquoten der Matrix dauert etwa 3 Stunden.
4. Nach dem Gewebeaufschluss das Zentrifugeröhrchen bei 175 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um ein Zellpellet zu bilden.
5. Entfernen Sie den Überstand, schnippen Sie mit dem Röhrchen, um das Zellpellet zu lösen, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml vorgewärmtem Trypsin, das mit 10 μM Y-27632 Rock Inhibitor ergänzt wird. Legen Sie die Tube für 5 min in ein 37 °C heißes Wasserbad.
6. Pipettieren Sie nach der Inkubation 5 Mal mit einer Standardspitze P1000 auf und ab. Den Schlauch für weitere 5 min in das 37 °C warme Wasserbad stellen und Schritt 2.6.
   wiederholen HINWEIS: Erwärmen Sie zu diesem Zeitpunkt des Eingriffs eine sterile 6-Well-Zellkulturschale, indem Sie sie in einen 55 °C heißen Inkubator stellen.

3. Zählen von Zellen und Resuspension in der Matrix

1. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 9 mL kaltem AdDMEM/F12(+++) und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 175 x g für 5 min bei 4 °C.
2. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, schnippen Sie mit dem Röhrchen, um das Pellet zu lösen, und waschen Sie die Zellen erneut, indem Sie 10 mL kaltes AdDMEM/F12(+++) hinzufügen. Das Röhrchen bei 175 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
3. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, schnippen Sie mit dem Röhrchen, um das Pellet zu lösen, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml AdDMEM/F12(+++) und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer gemäß dem Standardverfahren.
4. Sieben bis acht Kuppeln passen in eine Vertiefung einer 6-Well-Schale, wenn Organoide tropfenweise in die Matrix eingebracht werden. Etwa 200 μl Matrix ergeben 7-8 Kuppeln. Entscheiden Sie, wie viele Vertiefungen mit Organoiden für zukünftige experimentelle Zwecke benötigt werden, und berechnen Sie das erforderliche Matrixvolumen. Berechnen Sie dann das Volumen der zellhaltigen Lösung, das für eine Endkonzentration von 1,0 x 10⁶ Zellen/ml Matrix erforderlich ist.
5. Nach dem Zählen der Zellen bei 175 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, schnippen Sie mit dem Röhrchen, um das Pellet zu lösen, und suspendieren Sie die Zellen wieder in dem in Schritt 3.4.
   berechneten Matrixvolumen. HINWEIS: Die Matrix bleibt nur bei 4 °C in flüssiger Form; Bewahren Sie Matrix-Standard-Röhrchen und Matrix-Zell-Lösungen immer auf Eis auf.

4. Beschichtung von Matrixkalotten und Auftragen von Medien

1. Mischen Sie die Matrix-Zell-Lösung mit einer P200-Pipette, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, ohne Blasen zu bilden. Nehmen Sie die 6-Well-Kulturschale aus dem 55 °C-Inkubator.
2. Pipettieren Sie vorsichtig 200 μl Matrixzelllösung und lassen Sie die Lösung schnell in eine Vertiefung fallen, um Kuppeln zu bilden.
3. Schritt 4.2 wiederholen, bis das Volumen der Matrixzellenlösung aufgebraucht ist. Lassen Sie die Kuppeln 2 Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren.
4. Drehen Sie die 6-Well-Schale auf den Kopf und stellen Sie die Form in einen 37 °C heißen Inkubator, um die Erstarrung 20 Minuten lang fortzusetzen.
5. Geben Sie nach der Inkubation 2 ml Maus-Prostata-Organoidmedien in jede Vertiefung. In jede Vertiefung wird synthetisches Androgen R1881 für eine Endkonzentration von 1 nM und Y-27632 Rock Inhibitor bis zu einer Endkonzentration von 10 μM gegeben. Sorgfältig mischen und die Platte zur Kultivierung in einen 37 °C heißen Inkubator stellen.
   HINWEIS: Organoid-Nährmedien müssen nur 1 Woche nach der Organoiderzeugung mit 10 μM Y-27632 Rock-Inhibitor ergänzt werden.

Abbildung 1: Flussdiagramm des Protokolls zur Generierung von Prostatatumor-Organoiden. Nach dem Präparieren des Prostatatumors wird das Gewebe in 1 mm große Stücke zerkleinert. Verdauen Sie die Tumorstücke in Kollagenase, sammeln Sie die Zellen und verdauen Sie sie in Trypsin, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Nach dem Zählen der Zellen wird die Matrix in einem Volumen resuspendiert, das für eine Zellkonzentration von 1,0 x 106 Zellen/ml erforderlich ist. Kuppeln in der Schale mit einer tropfenweisen Methode anrichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.