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1. Synthese und Funktionalisierung von Nanopartikeln
VORSICHT: Alle Synthesen sollten in einem belüfteten chemischen Abzug stattfinden.
- Vor der Synthese werden ca. 300 ml deionisiertes (DI) Wasser durch einen 0,2 μm Sterilfilter filtriert.
- Reinigen Sie einen 250-ml-Glaskolben mit rundem Boden mit einer Reinigungslösung und spülen Sie ihn mit DI-Wasser aus. Fügen Sie 0,0134 g CuCl2 in 100 mL DI-Wasser hinzu, um eine 1 mM-Lösung zu erhalten.
- Geben Sie 0,015 g Folsäure (FA) in die CuCl2-Lösung und rühren Sie ~5 Minuten lang mit einem magnetischen Rührstab um.
- Na2S·9H2O (0,024 g in 100 μl DI-Wasser) über einen Zeitraum von ca. 10 s mit einer 200-μl-Pipette zum Reaktionsgemisch geben.
Anmerkung: Nach Zugabe von Na2S·9H2O verfärbt sich die Lösung von hellgelb zu dunkelbraun.
- Verschließen Sie die Reaktion und stellen Sie sie in ein auf 90 °C eingestelltes Ölbad und rühren Sie mit einem magnetischen Rührstab weiter. Nach ca. 15 min oder wenn das Ölbad 85-90 °C erreicht hat, lassen Sie die Reaktion eine weitere Stunde lang laufen. Deine Mischung sollte sich allmählich dunkelgrün verfärben.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass das System entlüftet wird, während Sie das Reaktionsgemisch erhitzen, um einen Druckaufbau zu vermeiden.
- Nehmen Sie das Reaktionsgefäß aus dem Ölbad und kühlen Sie es kurz bei Raumtemperatur für ca. 10 bis 15 Minuten ab, bevor Sie es in ein Eisbad überführen.
- Sobald das Reaktionsgemisch unter 20 °C abgekühlt ist, stellen Sie den pH-Wert unter Verwendung von 1 M NaOH auf 10 ein, um die restliche Folsäure in Lösung aufzulösen.
- Das FA-CuS-Reaktionsgemisch wird mit einer 30-kDa-Zentrifugationssäule aufgereinigt. Geben Sie die Lösung in 15-ml-Chargen in die Säule und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei 3.082 x g.
- Sobald das gesamte Reaktionsgemisch konzentriert ist, rekombinieren Sie die konzentrierten Fraktionen und waschen Sie sie 4x mit 15 mL pH 10 NaOH in der 30 kDa-Zentrifugationssäule.
- Für Massenmessungen nehmen Sie 1/3 der Lösung (~66 μL) und teilen Sie sie in drei Glasfläschchen auf. Über Nacht im Vakuumschrank bei 40 °C unter einem Vakuum von ~27 mmHg trocknen.
- Die anderen 2/3 der konzentrierten Lösung werden in 250 μl PBS aufgelöst und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.
- Bevor Sie die FA-CuS NPs verwenden, beschallen Sie sie 30 Minuten lang in einem Badsonicator auf hoher Stufe.
2. Aufnahme von FA-CuS NPs durch Eierstockkrebszellen
- Vor der Inkubation mit FA-CuS NPs sind SKOV-3-Zellen in einem T75-Kolben mit 8-15 ml folsäurefreiem RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin für mindestens 24 Stunden zu inkubieren.
- Aussaat der Zellen in 0,5 ml folsäurefreiem RPMI-1640 vollständigen Wachstumsmedium mit einer Dichte von 0,1 x 106 Zellen/ml in eine 24-Well-Platte.
- Am nächsten Tag inkubieren Sie die Zellen mit 400 μg/ml FA-CuS NPS in 0,5 mL folsäurefreiem RPMI-1640 vollständigem Wachstumsmedium für 2 h.
- Nach dieser Inkubation trypsinisieren Sie die Zellen mit 0,5 ml 0,25% Trypsin mit EDTA. Fügen Sie mindestens 1 ml folsäurefreies RPMI-1640 vollständiges Wachstumsmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 123 x g für 6 min.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL PBS und zentrifugieren Sie sie 6 Minuten lang bei 123 x g. Führen Sie diesen Waschschritt 2x durch, um alle ungebundenen NPs zu entfernen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1-2 ml PBS mit 2%iger Tween-Lösung.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Verdünnen Sie die Zellen ferner, wenn die Zellzahl zu hoch ist. Verdünnen Sie die Zellen in PBS mit 2% Tween auf die gewählte Konzentration für den Nachweis.
- Die Zellen sind nun bereit, mit dem PAFC-System analysiert zu werden.