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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Präparation von Mitochondrien aus menschlichem Eierstockkrebsgewebe
Eierstockgewebeproben einschließlich Eierstockkrebsgewebe (n = 7) wurden für dieses Protokoll verwendet.
- Bereiten Sie 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers vor, indem Sie 210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM Diamintetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM Ethylenglykolbis(2-aminoethylether)tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)-Proteasehemmer, 2 mM Natriumorthovanadat (V) und 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) mischen. pH-Wert 7,4.
- Legen Sie ~1,5 g Eierstockkrebsgewebe in eine saubere Glasschale.
- Fügen Sie 2 ml des vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffers hinzu, um das Blut 3x leicht von der Gewebeoberfläche zu waschen.
- Verwenden Sie eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in etwa 1 mm3 Stücke zu zerkleinern, und geben Sie das zerkleinerte Gewebe in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 13,5 ml mitochondrialen Isolationspuffer mit 0,2 mg/ml Nagarse hinzu und verwenden Sie dann einen elektrischen Homogenisator, um das zerkleinerte Gewebe (2 min, 10 s 6x, Intervall 10 s) zu homogenisieren (2 min, 4 °C).
- Geben Sie weitere 3 mL mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie diese durch Pipettieren gut durch.
- Das vorbereitete Gewebehomogenat zentrifugieren (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die rohe Kernfraktion (d. h. das Pellet) und behalten Sie den Überstand.
- Den Überstand rezentrifugieren (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die Mikrosomen (d. h. den Überstand) und bewahren Sie das Pellet auf.
- Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch leichtes Pipettieren.
- Die Pelletsuspension zentrifugieren (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie die rohen Mitochondrien (d. h. das Kügelchen).
- Fügen Sie 12 ml 25% Dichtegradientenmedium (d. h. Nycodenz) hinzu, um die extrahierten rohen Mitochondrien zu resuspendieren.
- Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, indem Sie ein Röhrchen von unten nach oben mit 5 mL mit 34 %, 8 mL mit 30 %, 12 mL mit 25 % (mit den rohen Mitochondrien aus Schritt 1.11), 8 mL mit 23 % und 3 mL mit 20 % Density-Gradientenmedium füllen und zentrifugieren (52.000 x g, 90 min, 4 °C).
- Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien an der Grenzfläche zwischen dem Gradientenmedium mit 25 % und 30 % Dichte in ein sauberes Röhrchen zu sammeln.
- Geben Sie mitochondrialen Isolationspuffer in die gesammelten Mitochondrien, um ihn auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifugieren (15.000 x g, 20 min, 4 °C) und den Überstand verwerfen.
- Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet zu resuspendieren und zu zentrifugieren (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf.
- Sammeln Sie das endgültige Pellet (d. h. die gereinigten Mitochondrien) und lagern Sie es bei -20 °C.
Anmerkung: Kombinieren Sie alle gereinigten Mitochondrien aus dem Eierstockkrebsgewebe als Mitochondrienprobe für die quantitative Proteomik-Analyse.