Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Erzeugung einer in vitro VX2-Zelllinie
- Entnahme des VX2-Tumors aus dem Quadrizepsmuskel des Kaninchens und dem Wachstum in der Mausflanke.
- Tauen Sie gefrorene VX2-Tumorblöcke (1 cm x 1 cm) auf, zerkleinern Sie sie mit einer Skalpellklinge auf einer Kulturplatte und passieren Sie sie durch einen 70-μm-Filter, indem Sie nacheinander kleine Mengen Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) hinzufügen, um sicherzustellen, dass alle Zellen für ein endgültiges Volumen von 1 ml abgesiebt werden.
- Zellen zählen und mit 0,9%iger phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 1 x 107/ml verdünnen und in einem sterilen Röhrchen auf Eis legen.
Anmerkung: Die Tumorblöcke wurden von einem Labormitarbeiter aus einer früheren Vermehrung von VX2-Tumoren in Quadrizepsmuskeln von Kaninchen gewonnen.
- Betäuben Sie ein weibliches weißes neuseeländisches Kaninchen (Gewicht 2,5-3,5 kg) mit 2-5% inhaliertem Isofluran, entfernen Sie das Fell über der Injektionsstelle und reinigen Sie die Injektionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung. Injizieren Sie 500 μl der vorbereiteten VX2-Zellsuspension (5 x 106 Zellen/ml) in den Quadrizepsmuskel des Kaninchens. Überwachen Sie das Kaninchen ab Tag 10 klinisch auf Tumorwachstum.
- Euthanasieren Sie die Kaninchen, nachdem die Tumore einen Durchmesser von 1-1,5 cm erreicht haben (extern mit Messschiebern gemessen) mit einer vom Tierarzt zugelassenen Methode. Bestätigen Sie die Sterbehilfe, indem Sie die Vitalparameter wie Herzfrequenz und Atemfrequenz überprüfen. Entfernen Sie den Tumor mit sterilen Instrumenten, nachdem Sie den Bereich mit Betadinlösung gereinigt haben.
- In einer biologischen Sicherheitswerkbank wird der Tumor auf einer 10 cm großen Gewebekulturschale mit sterilen Instrumenten mit einer Skalpellklinge in kleine Stücke (0,2 cm) zerkleinert. Die Tumorfragmente werden mit 1 ml HBSS durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. Zellen zählen und mit 0,9% iger Kochsalzlösung verdünnen, um 7,5 x 105 Zellen in 200 μl zu erhalten.
- Betäuben Sie männliche NOD-SCID-Gamma-Mäuse (Gewicht 25 g) mit 4 % Isofluran bei 1 l/min und halten Sie die Anästhesie mit 2 % Isofluran aufrecht. Sobald die Mäuse anästhesiert sind, injizieren Sie 200 μl der Lösung aus Schritt 1.1.5 mit einer 27-Gauge-Nadel in das Unterhautgewebe der Mausflanke.
- Ernte und Passage von VX2-Zellen in vitro
- Überwachen Sie das Wachstum von Xenotransplantaten zweimal wöchentlich klinisch, bis die Tumoren einen Durchmesser von 1 cm erreichen, mit Messschiebern.
- Euthanasieren Sie Mäuse, indem Sie sie in eine CO2 -Kammer legen oder eine Gebärmutterhalsdislokation nach Betäubung mit 4% Isoflurangas durchführen. Exzisieren Sie Tumore unter sterilen Bedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank.
- Zerkleinern Sie Tumore mit einem Skalpell in 1-2 mm große Stücke in einer 6 cm großen Gewebekulturschale, die 3 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham's F12+ 10% fetales Rinderserum (FBS) Medium enthält.
- Lassen Sie die Tumorfragmente zwei Tage lang ungestört in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2, bis die Zellen aus den Tumorstücken herauszuwachsen beginnen. Überprüfen Sie anschließend die kultivierten Platten täglich durch Lichtmikroskopie auf Zellkonfluenz. Bei Erreichen einer Konfluenz von 70 % trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 0,05 % Trypsin in den Kolben geben und für 5 Minuten wieder in den 37 °C-Inkubator stellen.
- Trypsin mit 6 mL DMEM/Ham's F12 + 10% FBS-Medium neutralisieren, Zellen sammeln und bei 4 °C für 5 min bei 300 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 3,5 ml des neuen DMEM/Ham's F12 + 10 % FBS-Medium. Saatgutfrische 6 cm Kollagen I beschichtete Platten mit 1,6 x 106 Zellen pro Platte, um eine Zellaussaatdichte von ca. 50 % zu erreichen.
HINWEIS: 50 % Zelldichte bezieht sich auf die Zellen, die 50 % der Oberfläche der Platte einnehmen, wenn sie angebracht sind.
- Frühe Passage: Wiederholen Sie den obigen Vorgang (Trypsinisieren, Seeding), bis die Zellen 5 Mal passageiert wurden, und beurteilen Sie dann die Reinheit der Zelllinien mit PCR unter Verwendung eines quantitativen PCR-Assays, um genomische DNA von Kaninchen von genomischer DNA der Maus zu unterscheiden (siehe Schritt 1.3.1-1.3.4).
Anmerkung: Nach 8 Passagen können die Zellen auf nicht mit Kollagen beschichteten, normal haftenden Gewebekulturplatten vermehrt werden.
- Passage, Trypsinisierung und Einfrieren von Aliquoten von Zellen in DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO in einer Konzentration von 2 x 106 pro Fläschchen. Lagern Sie die Zellen in flüssigem Stickstoff, bis sie für Experimente benötigt werden.
- Bestätigung der VX2-Herkunft überlebender Zellen:
- Erstellen Sie ein Standardheilmittel aus gereinigter genomischer DNA von Mäusen und Kaninchen (Schritt 1.3.2 und Schritt 1.3.3). Verwenden Sie Primer, die auf speziesspezifische Sequenzen innerhalb des zweiten offenen Leserahmens des LINE-1-Retrotransposon-Elements abzielen.
Anmerkung: Primer-Sequenzen für CRPV E6 sind: 5's-GATCCTGGACCCAACCAGTGund 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Es wurden die LINE-1 Retrotransposon-Elemente verwendet. Primersequenzen für Kaninchen LINE-1 sind: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC und 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Primersequenzen für Maus LINE-1 sind: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG und 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- Um eine Standardkurve für CRPV E6 zu erstellen, reinigen Sie VX2-Tumorzelllysat (Schritt 1.1.1) mit einem kommerziellen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Quantifizieren Sie diese DNA mit einem kommerziellen Assay. Führen Sie 6 serielle Verdünnungen von 225 pg/μl bis 0,925 pg/μl in einem Puffer mit niedrigem EDTA-TE-Gehalt durch. Um eine Standardkurve für genomische DNA von Mäusen zu erstellen, verdünnen Sie 100 μg handelsübliche genomische DNA von Mäusen in einem Puffer mit niedrigem EDTA-TE-Gehalt in 5 Verdünnungen von 125 pg/μl auf 0,0125 pg/μl.
- Von jeder verdünnten Lösung aus den Proben aus Schritt 1.3.2 werden 4 μl in die Vertiefungen gegeben und die Proben in einen PCR-Thermocycler gegeben. Verwenden Sie die Cq-Werte aus jedem Lauf zusammen mit den DNA-Mengen pro Well, um eine Standardkurve mit den Einstellungen für den automatischen Schwellenwert der Thermocycler-Software zu berechnen.
- Verwenden Sie Standard-qPCR-Verfahren, um eine PCR mit 40 Zyklen von 2-stufigen Zyklen (98 °C und 60 °C) auf einem Thermocycler durchzuführen. Legen Sie Schwellenwerte fest und legen Sie die Delta-Ct-Werte auf >35 fest, um sicherzustellen, dass die VX2-Zelllinie des Kaninchens nur minimal mit Mäusen kontaminiert ist. Das Gesamtvolumen jeder Reaktion betrug 10 μl, bestehend aus 5 μl 2x Mastermix, 1 μl Vorwärts- + Rückwärtsprimer mit einer endgültigen Primerkonzentration in der Reaktion bei 250 nM und 4 μl DNA-Probe.
Anmerkung: Es werden Schwellenwerte festgelegt, und die Delta-Ct-Werte werden auf >35 festgelegt, um sicherzustellen, dass die VX2-Zelllinie des Kaninchens nur minimal mit der Maus kontaminiert ist. Der empfohlene Gehalt an VX2-DNA für einen zuverlässigen Nachweis durch qPCR beträgt 1-10 pg.
>2. VX2-Zellkultur und Herstellung von Zellsuspension
- Durchstechflaschen mit VX2-Zellen (eingefroren in Schritt 1.2.7) werden 1 Minute lang in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Kulturmedium (1:1 DMEM/F-12 + 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin) überführt. 8 min bei 107 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Küvettenpellet in 9 mL Medium wieder suspendieren.
- Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in einen großen Kulturkolben. Inkubieren Sie die Zellen ohne Schütteln bei 37 °C. Überprüfen Sie die Zellen täglich mit der Lichtmikroskopie auf Konfluenz und wechseln Sie alle drei Tage das Kulturmedium.
- Herstellung einer kultivierten VX2-Zellsuspension für die Injektion
- Trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie 3 ml 0,25 % Trypsin in den Kolben geben, sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Kolben für 5 Min. in den Inkubator (37 °C) stellen. Die Lösung in ein konisches Zentrifugenröhrchen umfüllen und 8 min bei 107 x g zentrifugieren und dann den Überstand entfernen.
- Waschen Sie die Zellpellets 3 Mal mit 9 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung, zentrifugieren Sie sie und entfernen Sie den Überstand wie oben. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie mit 0,9 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 4 x 107 Zellen/ml und legen Sie sie in ein steriles konisches Zentrifugenröhrchen auf Eis.
- Herstellung einer in vivo vermehrten VX2-Zellsuspension für die Injektion
- Gefrorene VX2-Tumorblöcke (1 cm x 1 cm) auftauen, mit einer Skalpellklinge auf einer Kulturplatte zerkleinern und wie in Schritt 1.1.1 durch einen 70 μm Filter passieren. Fügen Sie nacheinander kleine Mengen HBSS hinzu, um sicherzustellen, dass alle Zellen für ein Endvolumen von 1 ml gespannt sind. Zellen zählen und mit 0,9 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 1 x107/ml verdünnen und in einem sterilen Röhrchen auf Eis legen.
Anmerkung: Die Tumorblöcke wurden von einem Labormitarbeiter aus einer früheren Vermehrung von VX2-Tumoren in Quadrizepsmuskeln von Kaninchen gewonnen.
>3. Etablierung eines chirurgischen Modells
- Etablierung der chirurgischen Anästhesie und präoperative Vorbereitung
- Weibliche weiße neuseeländische Kaninchen (2,5-3,5 kg) 1 h vor dem geplanten chirurgischen Eingriff mit Injektionen von Acepromazin (1 mg/kg IM) und Meloxicam (0,2 mg/kg SQ) vormedizieren. Betäuben Sie ein weibliches weißes neuseeländisches Kaninchen (Gewicht 2,5-3,5 kg) mit 2-5% inhaliertem Isofluran, entfernen Sie das Fell über der Injektionsstelle und reinigen Sie die Injektionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung.
- Intubieren Sie anästhesierte Kaninchen mit einer Kehlkopfmaske (LMA) und befestigen Sie sie mit Klebeband, wobei Sie eine tiefe Anästhesie aufrechterhalten, indem Sie die inhalative Isofluran-Dosis zwischen 2 und 5 % titrieren. Überwachen Sie die chirurgische Anästhesie regelmäßig während des gesamten Eingriffs, indem Sie die Vitalparameter (Atemfrequenz, Kapillarauffüllung, Sauerstoffsättigung, falls verfügbar) überprüfen und auf Anzeichen von Schmerzen (Bewegung, Rückzug von Reizen, Geräusche) oder Lichtnarkose (Bewegung, Kauen auf LMA-Schlauch) achten.
Anmerkung: Dies sollte von jemandem durchgeführt werden, der Erfahrung in der Überwachung einer chirurgischen Anästhesie hat.
- Legen Sie einen 22-Gauge-Ohrvenenkatheter in die marginale dorsale Vene. Cefazolin (20 mg/kg) 10 Minuten vor dem chirurgischen Hautschnitt intravenös verabreichen.
- Schneiden Sie Haare über das Becken und den Bauch, bevor Sie das Kaninchen auf den Operationstisch legen, und platzieren Sie die Kaninchen dann in Rückenlage auf dem Operationstisch. Reinigen Sie das Operationsfeld mit einer 3-stufigen chirurgischen Hautvorbereitung (Betadinseife, Chlorhexidinlösung, Betadinlösung). Drapieren Sie das Operationsfeld mit Laparotomietüchern, nachdem Sie die Oberseite des Schambeins markiert haben, und lassen Sie einen 5 cm x 5 cm großen Bereich des Unterbauchs frei.
- Erstellung des Laparotomie-Schnitts und Identifizierung der Gebärmutterhörner
- Setzen Sie eine OP-Kappe und eine Gesichtsmaske auf. Scheuern Sie die Hände mit Chlorhexidin oder Betadin chirurgischer Peelinglösung. Ziehen Sie in steriler Technik einen sterilen Kittel und sterile OP-Handschuhe an.
- Machen Sie mit einem Skalpell # 11 Klinge einen 2,5 cm langen Schnitt 1 cm kranial zur Symphyse Schambein durch die Haut und das Unterhautgewebe des Kaninchenbauchs. Schneiden Sie die Rektusfaszie und präparieren Sie die Rektusmuskeln lateral, um das darunter liegende Peritoneum freizulegen. Treten Sie scharf in das Peritoneum ein, nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Unterseite frei von Darm oder anderen Bauchorganen ist.
- Lokalisieren Sie die Gebärmutterhörner, um die Harnblase zu identifizieren, und streichen Sie mit einem behandschuhten Finger nach oben, hinten und seitlich über die Spitze der Blase.
Anmerkung: Bei Bedarf kann die volle Blase mittels digitalem Druck entleert werden. Sobald sie lokalisiert sind, bringen Sie die Gebärmutterhörner durch den Bauchschnitt, um auf der Bauchdecke zu ruhen.
- Führen Sie mit einer geflochtenen resorbierbaren Naht 3-0 eine einzelne Nahtligatur jedes Uterushorns etwa 1,5-2,0 cm distal der Gebärmutterhals durch. Legen Sie die Naht genau medial zu den Gebärmutterarterien, die entlang der lateralen Seite jedes Horns verlaufen. Binden Sie die Nähte eng an, um die distalen Gebärmutterhörner zu verschließen (Abbildung 1).
- Myometriale VX2-Inokulation
- Injizieren Sie mit einer 27-Gauge-Nadel 0,5 ml der zuvor hergestellten VX2-Zellsuspension aus Schritt 2.3.2 (für kultiviertes VX2-Modell) oder 2,4 (für in vivo vermehrtes VX2-Modell) in das Myometrium jedes Gebärmutterhorns proximal der Nahtstelle (zwischen der Nahtstelle und dem Gebärmutterhals). Injizieren Sie über 1 Minute und stellen Sie sicher, dass keine Zellen in die darunter liegende Gebärmutterhöhle injiziert werden. Betäuben Sie die Tiere mit inhalativem Isofluran (2-5%) und einem Anästhesiegerät mit einem Bain-Kreislauf
.
- Üben Sie nach der Injektion 30 s lang Druck auf die myometriale Injektionsstelle aus, um das Austreten von Zellen zu minimieren. Untersuchen Sie die Injektions- und Nahtstellen auf Blutstillung und legen Sie die Gebärmutterhörner wieder in den Bauch.
- Verschluss des chirurgischen Schnittes
- Tiefer Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie die Spitze des Peritonealschnitts und fassen Sie das Bauchfell, den Rektusmuskel und die Faszien mit einer Gewebszange.
- Verankern Sie dazu die Naht an einem Scheitelpunkt des Schnitts, indem Sie auf einer Seite des Schnitts oberflächlich bis tief und auf der anderen Seite tief bis oberflächlich nähen. Binde einen Knoten. Machen Sie mit der beigefügten Naht Laufstiche senkrecht zum Schnitt durch die Schichten der Bauchdecke, indem Sie sich schrittweise entlang des Schnitts von Seite zu Seite vorarbeiten. Binden Sie die Naht und schneiden Sie.
- Oberflächlicher Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie den Scheitelpunkt des Hautschnitts und nähen Sie die Bauchhaut mit einer vergrabenen verlaufenden subkutikulären 3-0 resorbierbaren Polyfilamentnaht. Tragen Sie chirurgischen Kleber auf den geschlossenen Schnitt auf, um die Hautränder zu berühren.
- Verankern Sie dazu die Naht an einem Scheitelpunkt des Schnitts, indem Sie auf der einen Seite des Schnitts tief bis oberflächlich und auf der anderen Seite oberflächlich bis tief nähen. Binde einen Knoten. Machen Sie mit den angebrachten Nähten Laufstiche in der Hautschicht parallel zum Schnitt und arbeiten Sie sich schrittweise entlang des Schnitts von Seite zu Seite vor. Binden Sie die Naht und schneiden Sie.
- Nachsorge
- Erwachen aus der Narkose: Schalten Sie das Isofluran aus, sobald der Schnitt geschlossen ist, und lassen Sie das Kaninchen mit der Maske Sauerstoff atmen, während Sie auf Anzeichen des Erwachens achten (z. B. spontane Bewegungen, Augenöffnung und Kaubewegungen auf den Atemwegen der Kehlkopfmaske). Extubieren Sie das Kaninchen, sobald diese Anzeichen bemerkt wurden, und versorgen Sie es mit einer Maske und einer warmen Decke, bis die Kaninchen wach sind und in der Lage sind, selbstständig zu sitzen.
- Postoperative Überwachung: Überwachen Sie die Kaninchen 4 Tage lang zweimal täglich und weitere 10 Tage nach der Operation täglich. Zur Überwachung, Beurteilung des Allgemeinzustands, der Nahrungs- und Wasseraufnahme, der Urin- und Stuhlausscheidung, der Schmerzbeurteilung, des Gewichts, der Vitalparameter (Herzfrequenz, Atemfrequenz) und der Operationsstelle, die auf Schwellungen, Rötungen, Ausfluss oder Dehiszenz achtet.
- Postoperative Schmerzkontrolle: Verabreichen Sie Meloxicam täglich (0,2 mg/kg SQ) für 48 Stunden nach der Operation und dann nach Bedarf auf der Grundlage der Schmerzbeurteilung. Verabreichen Sie Buprenorphin sofort nach der Operation und alle 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) für 24 Stunden und dann nach Bedarf auf der Grundlage der Schmerzbeurteilung
- Antibiotika (Enrofloxacin 5 mg/kg IM) können sieben Tage lang täglich nach der Operation verabreicht werden, um eine Wundinfektion zu verhindern, wie von Ihrem Tierarzt empfohlen. Verabreichen Sie zweimal täglich subkutane Flüssigkeiten (15 ml SQ), je nach Bedarf für die Dehydrierung, und weiche Lebensmittel oder andere Nahrungsergänzungsmittel werden täglich nach Bedarf zur Gewichtsabnahme bereitgestellt.
