Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Einrichten und Inkubieren des ITO-behandelten Objektträgers für Kokulturen
- Ungeteilte Kokulturen
- Die Agarose bei 70 °C auf einer heißen Platte verflüssigen.
- Platzieren Sie den 8-Well-Teiler auf dem mit Indiumzinnoxid (ITO) behandelten Objektträger (Abbildung 1A). Die Gummiunterseite des Teilers hilft bei der Haftung am Objektträger, aber achten Sie darauf, während der Agarosebeschichtung einen kontinuierlichen sanften Abwärtsdruck auszuüben, um sicherzustellen, dass keine Lecks oder Vermischungen zwischen den Vertiefungen auftreten.
- Sammeln Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen, zentrifugieren Sie sie (5 min bei 800 U/min) und resuspendieren Sie sie auf 50 k-Zellen pro 150 μl in 1x DMEM-Medien. Wenn eine andere Zelldichte optimal ist, stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension in diesem Schritt das 2-fache der gewünschten Enddichte beträgt (z. B. bei einer Endkonzentration von 50.000 Zellen in 300 μl beträgt die Zelldichte in diesem Schritt 50.000 Zellen in 150 μl).
- Geben Sie vor dem Plattieren der Zellkultur ein Ovarialexplantat in die Mitte der Vertiefung (Abbildung 1B).
- Geben Sie Agarose zu jeder Zellkultur in einzelnen 2-ml-Röhrchen kurz vor dem Plattieren. Kombinieren Sie für jede Vertiefung 200 μl Zellsuspension und 200 μl verflüssigte Agarose in einem 2-ml-Röhrchen. Kombinieren Sie beispielsweise für vier Vertiefungen 800 μl Zellsuspension und 800 μl 2 % Agarose. Etwas Mischung bleibt übrig, aber wenn Sie etwas mehr als nötig machen, vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren.
- Fügen Sie einzelnen Zellkulturen unmittelbar vor dem Plattieren dieser Zellkultur Agarose hinzu. Die Agarose kühlt in weniger als einer Minute ab, also bereiten Sie sich darauf vor, schnell anzurichten.
- Geben Sie sofort 300 μl des Zell-Agarose-Gemisches in jede Vertiefung (Abbildung 1C). Abbildung 1C zeigt drei Zellbedingungen und einen Medienzustand, die jeweils mit und ohne Eierstock plattiert sind.
- Objektträger bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.
- Geteilte Kokulturen
- Trennwände aus dünnem, glattem Kunststoff ausschneiden (Abbildung 2A).
Anmerkung: In diesem Experiment werden die Seiten eines sterilen Einwegmedienbeckens verwendet, da sie flach und dünn sind. Schneiden Sie sie gerade so breit ab, dass sie genau in die Hypotenuse der Vertiefung passen (~13 mm).
- Die Agarose bei 70 °C auf einer heißen Platte verflüssigen.
- Platzieren Sie den 8-Well-Teiler auf dem ITO-behandelten Objektträger (Abbildung 2B). Die Gummiunterseite des Teilers hilft bei der Haftung am Objektträger, aber achten Sie darauf, während der Agarosebeschichtung einen kontinuierlichen sanften Abwärtsdruck auszuüben, um sicherzustellen, dass keine Lecks oder Vermischungen zwischen den Vertiefungen auftreten.
2. Trocknen des Objektträgers und Vorbereiten für MALDI-TOF MS
- Entfernen Sie nach vier Tagen (oder einem beliebigen Zeitpunkt) den Kammerteiler von den Agarosestopfen und dem Objektträger (Abbildung 1D). Lösen Sie die Seiten der Agarose vorsichtig mit einem flachen Spatel von der Kammer und ziehen Sie die Kammer vorsichtig nach oben, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Agarose-Stöpsel bewegen. Wenn sie sich bewegen, positionieren Sie sie vorsichtig so, dass sie sich nicht berühren.
- Stellen Sie die Schiene für ca. 4 Stunden in einen 37 °C heißen Ofen und drehen Sie sie stündlich um 90°.
Anmerkung: Die Drehung des Objektträgers ist wichtig, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung in der Probe zu gewährleisten.
- Nehmen Sie den Objektträger nach dem Trocknen aus dem Ofen (Abbildung 1E).
- Tragen Sie die Matrixlösung mit dem Sprühgerät (Abbildung 1F) mit folgenden Parametern auf: Temperatur = 30 °C, Durchflussrate = 0,2 mL/min, Anzahl der Durchgänge = 8, Richtung = CC und Düsenabstand = 40 mm.
Anmerkung: Anstelle eines Matrixsprühers kann eine kunstvolle Airbrush zum Auftragen der flüssigen Matrix verwendet werden. Zum Sprühen kann die gleiche Matrixlösung verwendet werden, es wird jedoch etwa doppelt so viel Lösung benötigt. Sprühen Sie den Objektträger so fest, dass er senkrecht hängt, und sprühen Sie den Objektträger aus einem 90°-Winkel von etwa einem Fuß Entfernung, bis die Matrixschicht sichtbar ist.
- Fügen Sie 1 μl Kalibrant (Phosphorrot für Ziele <500 Da, eine Peptidmischung (siehe Materialtabelle) für Ziele <5.000 Da) hinzu, um die Flecken auf dem Objektträger zu entfernen. Phosphorrot erfordert kein Mischen mit der Matrix, aber das Peptidgemisch erfordert eine 1:1-Mischung mit der Matrix, um die Ionisation zu unterstützen. Warten Sie, bis das Kalibrant getrocknet ist.
- Zeichnen Sie ein X mit einem Permanentmarker an jeder Ecke der Folie und nehmen Sie ein optisches Bild mit einer Kamera oder einem Scanner mit 1.200 dpi auf.
