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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Gold-Nanostar-Kernsynthese
HINWEIS: Gold-Nanosterne werden als Kerne für beide Varianten von SERRS-Nanosonden verwendet, die in diesem Experiment verwendet wurden.
- Bereiten Sie 800 mL 60 mM Ascorbinsäure (C6H8O6) Lösung in deionisiertem (DI) Wasser und 8 mL 20 mM Tetrachloraurensäure (HAuCl4) Lösung in DI Wasser vor. Auf 4 °C abkühlen lassen.
- Dieser Reaktionsschritt wird bei 4 °C durchgeführt. Ein Erlenmeyerkolben mit 800 ml Ascorbinsäurelösung wird auf eine magnetische Rührplatte gestellt und ein gleichmäßiger Wirbel induziert. Geben Sie schnell 8 ml der Tetrachloraurensäurelösung in den Vortex. Innerhalb von Sekunden bilden sich Nanosterne und die Lösung nimmt eine dunkelblaue Farbe an. Wenn die Farbe zu irgendeinem Zeitpunkt rosa oder violett wird, was auf die Bildung von Nanokügelchen hinweist, sollte die Suspension verworfen und die Synthese erneut versucht werden.
- Gießen Sie die nanostar-Suspension in konische 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 20 Minuten lang (4 °C, 3.220 x g). Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie etwa 200 μl der Lösung in jedem Röhrchen. Achten Sie darauf, das Pellet aus Nanopartikeln am Boden des Röhrchens nicht zu stören.
Anmerkung: Der Überstand sollte aufgrund der verbleibenden schwebenden Nanosterne einen blauen Farbton haben.
- Rühren Sie die Lösung mit einer Mikropipette auf, um die Nanopartikel aus jedem Röhrchen zu suspendieren und zu sammeln. Ein Teil des Pellets kann am Boden des Röhrchens verdichtet sein und lässt sich auch bei kräftigem Pipettieren nicht resuspendieren – entsorgen Sie diesen Teil.
- Übertragen Sie die Nanopartikelsuspension in eine Dialysekassette (MWCO 3,5 kDa) und dialysieren Sie mindestens drei Tage lang gegen 2 l DI-Wasser, wobei das Wasser täglich gewechselt wird. Lagern Sie Nanosterne in der Dialyse bei 4 °C für bis zu einem Monat mit Wasserwechsel alle 3-4 Tage.
Anmerkung: Die Nanosterne sollten in der Dialyse aufbewahrt werden, bis sie für die Silikationsreaktion erforderlich sind, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
>2. Bildung der Silica-Hülle
HINWEIS: Es werden zwei Varianten von Raman-Nanosonden synthetisiert. Das Syntheseverfahren ist für beide gleich, mit dem einzigen Unterschied in dem verwendeten Raman-Reportermolekül (Farbstoff). In diesem Versuch werden IR780 Perchlorat und IR140 verwendet. Die Reaktion sollte immer in Kunststoffbehältern durchgeführt werden. Die Synthese ist hochgradig skalierbar und kann auf die gewünschte Menge an benötigtem Injektat eingestellt werden. Hier wird eine Medium-Batch-Synthese beschrieben, die je nach Bedarf linear auf niedrigere oder höhere Volumina skaliert werden kann, bei gleichen Konzentrationen und Reaktionszeiten. Die Reaktionen für die beiden SERRS-Nanosondentypen können parallel durchgeführt werden. Achten Sie darauf, Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Die Beschallung sollte für die Redispergierung von Nanopartikel-Pellets nach der Zentrifugation während der Waschschritte oder nach längerer Lagerung der Nanopartikel für mehr als eine Stunde durchgeführt werden. Die Beschallung sollte so lange durchgeführt werden, bis die Nanopartikel eindeutig in der Lösung suspendiert sind, typischerweise für 1 s.
- Mischen Sie in Röhrchen A (einem konischen 50-ml-Röhrchen) 10 mL Isopropanol, 500 μl TEOS, 200 μl DI-Wasser und 60 μl Farbstoff (IR780 Perchlorat oder IR140, 20 mM in DMF (Dimethylformamid)).
- Mischen Sie in Röhrchen B (einem konischen 15-ml-Röhrchen) 3 mL Ethanol und 200 μl Ammoniumhydroxid. Beschallen Sie die Nanosterne aus Schritt 1.4, um alle Cluster in Lösung zu dispergieren, und fügen Sie dem Röhrchen 1,2 mL Nanosterne hinzu.
HINWEIS: Die Ammoniumhydroxidlösung ist leicht flüchtig und schwer genau zu pipettieren. Lagern Sie es bis zur Verwendung bei 4 °C, um das Pipettieren zu erleichtern.
- Stellen Sie Tube A auf einen Wirbelmischer und induzieren Sie einen gleichmäßigen Wirbel. Geben Sie den Inhalt von Röhrchen B schnell in den Wirbel und mischen Sie ca. 5 s lang. Sofort in einen Schüttler umfüllen und 15 Minuten lang bei 300 U/min bei Raumtemperatur reagieren lassen.
- Nach der 15-minütigen Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von Ethanol zum Befüllen des 50-ml-Röhrchens gestillt. 20 min bei 3.220 x g und 4 °C zentrifugieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie etwa 0,5 ml Lösung übrig, wobei Sie darauf achten müssen, das Pellet nicht zu stören. Fügen Sie 1 ml Ethanol hinzu und rühren Sie mit einer Pipette um, um die Nanopartikel wieder zu suspendieren. In ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen und 4 Mal mit Ethanol waschen, indem es 4 Minuten lang bei 11.000 x g zentrifugiert, den Überstand ansaugt und das Pellet durch Ultraschall für ca. 1 s resuspendiert.
- HINWEIS: In diesem Stadium können die silikatisierten Nanopartikel funktionalisiert werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben, oder mit einem zusätzlichen Waschschritt in DI-Wasser resuspendiert werden, um sie bis zu einer Woche lang bei 4 °C zu lagern.
>3. Oberflächenfunktionalisierung
HINWEIS: IR780 SERRS-Nanosonden werden über einen PEG-Vernetzer mit Folatrezeptor-Antikörpern konjugiert, um αFR-NPs zu bilden; IR140 SERRS-Kontrollnanosonden werden mit einer passivierenden PEG-Monoschicht für nt-NPs konjugiert. Beide Geschmacksrichtungen werden über eine Thiol-Maleimid-Reaktion in getrennten, aber parallelen Reaktionen gebildet.
- Waschen Sie die Nanopartikel zweimal, indem Sie 4 Minuten lang bei 11.000 x g zentrifugieren, den Überstand ansaugen und das Pellet durch Ultraschall in 1 ml Ethanol resuspendieren. Wiederholen Sie den Waschschritt erneut, aber dispergieren Sie in 1 ml 85 % Ethanol, 10 % 3-MPTMS (3-Mercaptopropyltrimethoxysilan) und 5 % DI-Wasser. 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren, um Thiole auf die Partikeloberfläche einzubringen.
- Die Thiol-funktionalisierten Nanopartikel werden durch Zentrifugieren bei 11.000 x g für 4 min gewaschen, wobei der Überstand aspiriert und das Pellet durch Ultraschall resuspendiert wird, zweimal in Ethanol, zweimal in DI und schließlich in HEPES-Puffer (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure) (10 mM, pH 7,1) und beiseite gestellt.
- HINWEIS: Es sollte MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure)-Puffer oder HEPES verwendet werden. Puffer mit höherem Salzgehalt, wie z. B. PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), können eine Nanopartikelaggregation induzieren.
- Für die antikörperfunktionalisierten αFR-NPs reagieren 200 μg Antikörper (Anti-Folat-Bindungsprotein-Antikörperklon [LK26]) mit einem zehnfachen molaren Überschuss an PEG-Vernetzer (Poly(ethylenglykol)(N-hydroxysuccinimid-5-pentanoat)-ether, N'-(3-maleimidopropionyl)aminoethan (CAS: 851040-94-3), in Dimethylsulfoxid (DMSO)) in 500 μl MES-Puffer (10 mM, pH 7,1) für 30 min.
- Entfernen Sie überschüssigen Vernetzer und konzentrieren Sie den Antikörper, indem Sie die Antikörper-PEG-Lösung in einem Zentrifugalfilter (MWCO 100 kDa) zentrifugieren. Für die in dieser Studie verwendeten Zentrifugalfilter wird eine Zentrifugation von 10 Minuten bei 14.000 x g und 23 °C durchgeführt. Die konjugierten Antikörper werden in einem frischen Röhrchen zurückgewonnen, indem der Filter umgedreht und 2 Minuten lang bei 1.000 x g zentrifugiert wird.
- Pipettieren Sie die IR780-Nanopartikel aus Schritt 3.2 in das Röhrchen mit den Antikörpern und rühren Sie mit der Pipette zum Mischen. Die Mischung wird mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert, um die αFR-NP zu bilden.
- Um nt-NPs zu bilden, fügen Sie 1 % w/v methoxyterminiertes (m)PEG5000-Maleimid (CAS: 99126-64-4), gelöst in DMSO, zu den IR140 SERRS-Nanopartikeln aus Schritt 3.2 hinzu und lassen Sie es mindestens 30 μl MES-Puffer (10 mM, pH 7,1) mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht reagieren.
- Für die Verabreichung an Mäuse (Abschnitt 4) schleudern Sie beide Nanosonden-Flavors bei 11.000 x g für 4 min, aspirieren Sie den Überstand, um die Lösung mit freien, nicht umgesetzten Antikörpern/PEG zu entfernen, und dispergieren Sie jede Flavor in MES-Puffer (10 mM, pH 7,1) bei 600 pM-Konzentrationen. Bei der Resuspendierung der Nanopartikel ist die unnötige Exposition gegenüber dem Ultraschall zu minimieren, um eine Denaturierung des Antikörpers zu verhindern.
>4. Nanosonden-Injektion und Bildgebung
- Bereiten Sie Nanosonden (αFR-NPs und nt-NPs) vor, wie in den Abschnitten 1-3 beschrieben, und mischen Sie sie im Verhältnis 1:1 für eine Endkonzentration von 300 pM jedes Typs in MES-Puffer (10 mM, pH 7,1). Bereiten Sie optional Referenzstandards von 30 pM für jede der Nanosondenvarianten in kleinen (100 μl) konischen Röhrchen vor.
- Injizieren Sie intraperitoneal 1 ml der Nanopartikelsuspension in jede Maus und massieren Sie sanft den Bauch, um die Nanopartikel in der Bauchhöhle zu verteilen. Setzen Sie die Maus wieder in ihr Gehäuse ein. Nach 25 oder mehr Minuten euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung.
- Befestigen Sie die Maus auf einer chirurgischen Plattform in Rückenlage (für die Bildgebung des gesamten Bauches muss die Plattform auf dem aufrechten Mikroskoptisch montiert werden können).
- Entfernen Sie mit einer gezackten Pinzette und einer Präparierschere die Haut, um das Bauchfell freizulegen, und führen Sie einen großen sagittalen Schnitt (zwischen 2 und 3 cm Länge) durch, um den gesamten Bauch freizulegen. Befestigen Sie die Peritonealappen auf der Plattform. Waschen Sie das Innere der Bauchhöhle mit mindestens 60 ml PBS in einer Plastikspritzflasche.
HINWEIS: Um eine ungehinderte Bildgebung des gesamten Bauches zu ermöglichen, muss der Darm mobilisiert oder herausgeschnitten werden. Bei der Exzision resezieren Sie mit einer Ligatur der Mesenterialgefäße, um die Blutung in die Bauchhöhle zu reduzieren.
- Um bestimmte Organe abzubilden, können Sie sie nach der PBS-Wäsche herausschneiden und auf einen Objektträger legen.
- Übertragen Sie die Plattform oder den Objektträger auf ein Raman-Mikrospektrophotometer mit aufrechter optischer Konfiguration und einem motorisierten Tisch für die Bildgebung. Verwenden Sie ein kommerzielles System mit einem 300 mW 785 nm Diodenlaser mit einem Gitter von 1.200 Rillen pro mm, zentriert bei 1.115 cm-1.
- Fokussieren Sie sich auf das interessierende Gebiet mit Weißlichtoptiken, parfokal mit dem Raman-Laser. Wählen Sie den abzubildenden Bereich und die gewünschte Auflösung aus; In diesem Bericht wurde ein Hochgeschwindigkeits-Erfassungsmodus verwendet (Spektren, die unter kontinuierlicher Laserbeleuchtung bei ständiger Bewegung des Mikroskoptisches aufgenommen wurden, mit einer effektiven räumlichen Auflösung von 14,2 μm x 200 μm; bei 5-facher Vergrößerung, 100 mW Leistung am Objektiv und <100 ms Belichtung pro Punkt).
Anmerkung: Die Röhrchen mit den Referenz-Nanosonden aus Schritt 4.1 können auf Wunsch innerhalb des abgebildeten Bereichs platziert werden, um interne Referenzstandards für die anschließende Analyse bereitzustellen. Stellen Sie sicher, dass keine anderen Fremdlichtquellen als der Laser das Objektiv erreichen.
- Optional wird die Probe für die histologische Verarbeitung und Validierung vorbereitet, indem sie über Nacht bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert wird. Spülen Sie mindestens zweimal 15 Minuten lang mit PBS bei 4 °C. Bewahren Sie die Probe bis zur standardmäßigen histologischen Verarbeitung und Paraffineinbettung in 70 % Ethanol in Wasser auf. Zur histologischen Validierung der Tumoren können Schnitte (5 μm dick) aus unterschiedlichen Tiefen des Paraffinblocks mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) angefärbt werden.